注意：

1.試驗中使用(yòng)特定試劑盒的(dε↓®•e)标準品和(hé)抗體(tǐ)，不(bù)建議(yì)不(bù)₽'÷同試劑盒産品調換，因為(wèi)可(kě)能↔φε(néng)影(yǐng)響結果準确性。

2.标準曲線孔建議(yì)做(zuò)2 ​‍λ-3個(gè)複孔。

3.稀釋用(yòng)的(de)緩沖液中不(bù)‌π能(néng)含有(yǒu)疊氮化(huà↕✘)鈉，因為(wèi)其可(kě)以滅活辣根過氧化(huà)物(wù)酶。‍∑±$

标準品稀釋（如(rú)下(xià)圖）

1.按照(zhào)C of A說(shuō)明(míng)使用(yòng)檢測稀釋液配制(≤∏zhì)濃度為(wèi)500pg/ml 的(de)标準品溶液。

2.在高(gāo)親和(hé)ELISA闆子(zǐ)中從(cóng)B1和(hé)B2開(k<§$āi)始到(dào)H1和(hé)H2每孔分(fēn)别加入100ul檢測稀釋液。

3.取200ul的(de)濃度為(wèi)500pg/ml的 ® δ(de)标準品加入到(dào)A1和(hé)A×<2兩個(gè)孔中。

4.用(yòng)排槍從(cóng)A1和(hé)A2兩個(gè)孔中吸取10™₩∏0ul加入到(dào)對(duì)應的(de)B1和(hé)B2中，吹吸₩‍¥混合均勻，那(nà)麽 B1和(hé)B2标準品濃度為(wèi)250pg/ml。

5.從(cóng)B1和(hé)B2中吸取100>γα♥ul加入到(dào)C1和(hé)C2孔中，混勻，那(nà)麽C1和(hé"¶≈)C2孔标準品濃度為(wèi)125pg/ml。

6.按照(zhào)步驟4和(hé)5的(de)方法倍比稀釋到(dào)H1和(hé)H2兩孔。↔±γ≤H1和(hé)H2孔中标準品的(de)濃度是(shì)4pg/mlΩφ，體(tǐ)積為(wèi)200ul，取100ul棄掉。屆時(shí)每個(gè)孔标準品的(de'÷±)體(tǐ)積均為(wèi)100ul。

注意：4到(dào)6步驟稀釋速度要(yàoδ>≈)快(kuài)，避免時(shí)間(jiān)過長(cháng)，建議₽'≈(yì)使用(yòng)多(duō)通(tγ✘ōng)道(dào)排槍進行(xíng)。

7.設置A3和(hé)A4為(wèi)空(kōng)白(bái)對(duì)照(z  hào)（隻加100ul稀釋液），為(wèi)了(le)避免胡克©↕✔φ效應的(de)影(yǐng)響，我們建議(yì)可(k‌π≈↓ě)以采用(yòng)A1和(hé)A12作(zuò​≠÷)為(wèi)空(kōng)白(bái)對(duì)照(zhàoβ₩₹)孔，而不(bù)設置樣品或标準品。

結果計(jì)算(suàn)：（需要(yào)從(cóng)标準品OD值拟合出來(l‍£♥ái)方程來(lái)推算(suàn)樣品的(de)細胞因子(zǐ)的(de)含量）。

1.計(jì)算(suàn)标準品，空(kōng)白(bΩ‍♦ái)和(hé)樣品孔平均OD值。

2.樣品OD值減去(qù)空(kōng)白(bái)孔平均OD值。

3.利用(yòng)軟件(jiàn)拟合出4參數(shù)的(de)對(duì)數(shù)标 ​←‍準曲線，也(yě)可(kě)以使用(yòng)描點的(de)方法在坐(zuòφσ→)标中描繪出X軸為(wèi)标準品濃度，Y軸為(wèi)平均OD值的≈$α(de)各個(gè)點，然後大(dà)緻拟合出相(xiàng)應的(d>↕γ±e)曲線。最佳的(de)方法是(shì)使用(yòng)回歸分(Ω♥₽fēn)析的(de)方法拟合出标準曲線。

4.利用(yòng)标準曲線拟合的(de)公♣∞✔≠式去(qù)計(jì)算(suàn)樣品中細胞因子(zǐ)的(de)濃度 ÷λ。

5.如(rú)果在實驗前樣品經過稀釋，則結果需要(yào)乘于稀釋倍數(sh₩↑↔✘ù)。

儲存和(hé)穩定性說(shuō)明(míng)

1.EB的(de)ELISA試劑盒若按照(zhào)說(shuō)明(míng)書(shū)儲存¥≠♣α保質期為(wèi)6個(gè)月(yuè)。

2.試劑盒提供凍結的(de)标準品20ul/瓶，收到(dào)後請(↓₩↑qǐng)立即凍存與-80度冰箱，可(kě)保存6個(gè)月(yuè)；使用(yòng)≠>時(shí)融化(huà)離(lí)心1分(fēn)鐘(zhōng)，可(kě)避免标準品損→★失。請(qǐng)避免将标準品分(fēn)裝和(hé)反複凍融。每瓶标準品隻能(néng)用(yò÷>&☆ng)一(yī)次，剩餘失效。稀釋标準品步<ε✘♥驟請(qǐng)參照(zhào)說(shuō)明(míng)書∏₩(shū)第一(yī)部分(fēn)。

3.ELISA闆子(zǐ)請(qǐng)室溫儲存，其他(tā)試劑4¶ >度儲存即可(kě)。

實驗材料：

功能(néng)純化(huà)級别的(de​≥)捕獲抗體(tǐ)。

結合生(shēng)物(wù)素的(de)檢測抗體(tǐ)。

标準品。

10×ELISA包被緩沖液。

5×檢測稀釋液。

抗生(shēng)物(wù)素的(de)辣根過氧化(huà)物(wù)酶。

TMB底物(wù)。

高(gāo)親和(hé)力96孔闆（NUNC M$≠axisorp flat-bottom o€÷αr Corning Costar 9018）。

1×PBS+0.05%吐溫20（或者ELISA洗液 Cat.Noπ≤. 00-0400）

終止液：1M H3PO4 或者2N H2SO4

儀器(qì)

吸管和(hé)單通(tōng)或多(duō)通(tōng)移液器(q↕☆δì)

冰箱

排槍水(shuǐ)槽

分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)

洗闆機(jī)

實驗流程：

1.使用(yòng)無菌水(shuǐ)将包被液稀釋為(wèi)1×（注意：預先‌α将包被液平衡至室溫）。

2.用(yòng)1×包被液稀釋功能(néng)級别的(de)包被抗體(tǐ)¶§♦，包被ELISA闆子(zǐ)，每孔100ul，蓋闆，四度孵育過夜。

3.第二天稀釋檢測稀釋液（雙蒸水(shuǐ)稀釋），吸出闆子(zǐ)的∏¥φ↑(de)捕獲抗體(tǐ)溶液，用(yòng)300ul洗液洗闆3-5次，每次浸泡時(shí)間& λ(jiān)不(bù)小(xiǎo)于1min,吸水(shuσ♥ǐ)紙(zhǐ)上(shàng)排幹。

4.200ul檢測稀釋液封閉闆子(zǐ)，蓋闆，室溫孵育1小(x€→₹iǎo)時(shí)。

5.吸去(qù)檢測稀釋液，用(yòng)300ul洗液洗闆3-4次，每次浸泡時(↕×γ≤shí)間(jiān)不(bù)小(xiǎo)于1☆±min,吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)排幹。

6.按照(zhào)上(shàng)述說(shuō)明(míng)使用(yòng)1×檢測稀釋λ¥₩>液稀釋标準品（嚴格按照(zhào)說(shuō)明(míng ≤₹✔)書(shū)進行(xíng)）。

7.加100ul樣品和(hé)标準品到(dào)對δ§<λ(duì)應的(de)孔中，封闆，室溫孵育2個(gè)小(xiǎo)時(shí)或4度過•₩ 夜（高(gāo)靈敏度）。

8.孵育期間(jiān)，按照(zhào)說(shuō)明(míng)書(shū★₩‌)準備檢測抗體(tǐ)。

9.吸去(qù)樣品，用(yòng)300ul洗液洗闆5♣ ✘次，每次浸泡時(shí)間(jiān)不(bù)小&€(xiǎo)于1min,吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)排幹。

10.每孔加100ul檢測抗體(tǐ)，封闆，室溫孵育1個(gè)小(xiǎo)←€時(shí)。

11.孵育期間(jiān)，按照(zhàΩδo)說(shuō)明(míng)書(sh§→ū)準備抗生(shēng)物(wù)素的(≥←∑γde)HRP溶液。

12.每孔加100ul抗生(shēng)物(wù)素的(de)HR★∏©P溶液，封闆，室溫孵育0.5個(gè)小(xiǎo)時(shí)（避免♦♥∞&溶液中有(yǒu)疊氮鈉，因為(wèi)σ↕♦會(huì)影(yǐng)響HRP活性）。

13.吸去(qù)溶液，用(yòng)300ul洗液洗闆3-4次，每次浸泡時(shí)間(↓®>↑jiān)不(bù)小(xiǎo)于1min,吸水(s¶β★±huǐ)紙(zhǐ)上(shàng)排幹。

14.每孔加100ulTMB溶液，封闆，室溫孵育15min（注意：TMB要​↔∞(yào)預先平衡至室溫）。

15.加50ul終止液終止。

16.加終止液後30min內(nèi)檢₽$測，450nm讀(dú)闆。

附錄：緩沖液配制(zhì)方法

1X PBS: 

　80.0 g NaCl

　11.6 g Na2HPO3

　2.0 g KH2PO4

　2.0 g KCl

　以 1 L DI H2O定容 并調節 pH 值為(wèi)γγβ' 7.0

ELISA Wash Buffer:

　1 L 的(de)1X PBS

　0.5 mL Tween-20

　此外(wài), 也(yě)可(kě)以購(gòu)買ELISA洗液幹粉 (eBπλ∞↑io cat. # 00-0400) ，用(yòng)1 L DI H2O重懸。