1、Treg細胞概述

　　高(gāo)效免疫抑制(zhì)劑的(de)發現(xiàn©ε)及其聯合應用(yòng)使臨床器(qì)官移植的(de•π±)急性排斥反應大(dà)大(dà)降低(dī)，移植物(wù)的×↑(de)存活時(shí)間(jiān)明(míng)顯延長(cháng)；器♣δ♣∞(qì)官移植成為(wèi)挽救終末期器♠®©Ω(qì)官功能(néng)衰竭患者生(shēng)命的(de)重要(y$'®ào)有(yǒu)效途徑。但(dàn)是(shì)免疫抑制(zhì)劑具有(yǒu)明(míng≠∞)顯的(de)毒副作(zuò)用(yòng)(如(r∞₩"λú)對(duì)重要(yào)髒器(qì)的β•(de)損傷、降低(dī)抗腫瘤及抗感染免疫力等₹ )及對(duì)治療慢(màn)性排斥反應↔÷®效果較差等問(wèn)題，均限制(zhì)了(le)免疫抑制(zhì)劑的(de)長(cháng×®&)期應用(yòng)。因此，相(xiàng)關生(shēng)命科(kē)學工(gōng)作(σ✔β€zuò)者嘗試通(tōng)過誘導移植免疫耐受途徑來(lái)避免免♣©₩☆疫抑制(zhì)劑的(de)長(cháng)期應用(yòng)及★δ♠克服移植免疫排斥反應。

在上(shàng)個(gè)世紀九十年(nián)代☆↓™$中期，由Sakaguchi等首先證實了(le)天然CD±÷©4+ CD25+ 調節性T細胞(regulatory T cell，Tδβreg)為(wèi)一(yī)類具有(yǒu)免疫抑制(zhì)作(zu‌♥ ò)用(yòng)的(de)T細胞，約占外(wài)周血單個(gè)核細↕  胞（PBMC）2%～5%，約占外(wài)周CD4+T細™​$∑胞的(de)5～10%。該類細胞以“主動”的(de)方式參與® 免疫應答(dá)／免疫耐受的(de)調控，不(bù​→)僅參與自(zì)身(shēn)免疫耐受調節，而且在腫瘤免疫和(hé)‌✘<移植免疫中也(yě)具有(yǒu)重要(yào)的(de)作(zuò)用(yòng)。

2、Treg細胞的(de)來(lái)源

　　研究證實，天然的(de)CD4+CD25 ΩΩ+Treg細胞來(lái)源于胸腺，小(xiǎo)鼠出生(shēng)後第3δ✘σ 天切除胸腺，外(wài)周缺乏CD4+CD25+Treg細胞，産生(shēng)抗φ≤™自(zì)身(shēn)抗體(tǐ)并出現(xi★γàn)自(zì)身(shēn)免疫性胃炎等自(zì)身(shēn)免≥∞÷ 疫性疾病。而在第0天和(hé)第7天切除胸腺，并不(bù)表現(xiàn)自(z∑​≈ì)身(shēn)免疫性疾病。這(zhè)說(shuō)明(míng)出生(sλ §hēng)3d內(nèi)是(shì)胸腺産生(shēng)CD4+CD25+Treg細胞的(d÷♣∑e)關鍵時(shí)期，這(zhè)時(shí)切除胸腺₩☆引起自(zì)身(shēn)反應性CD4+T細胞的(de)過度λ♦≈§增殖。但(dàn)是(shì)，出生(shēng)第0天胸腺産生(shēng)的(de©♣)自(zì)身(shēn)反應性CD4+T細胞不(↑₩bù)足，出生(shēng)第7天胸腺已經産生(shēng)了(le)足夠的€•↑€(de)CD4+CD25+Treg細胞，所以這(zhè)時(shí)切除胸←→腺， 小(xiǎo)鼠不(bù)出現(xiàn)自(zì)身(ε↓shēn)免疫性疾病。Papiernik等證實，CD4+CD25+Treg細胞産生(shēng) ↕于胸腺，然後遷移到(dào)外(wài)周發揮作®£✘(zuò)用(yòng)，CD4+CD25+胸腺細胞與外(wài)™β周的(de)CD4+CD25+Treg細胞一(yī)樣，表現(xiàn)φ"對(duì)經由TCR的(de)抗原刺激呈&Ω低(dī)反應性，并且顯示抑制(zhì)其©∏他(tā)T 細胞增殖的(de)能(nén"​¶g)力。CD4+CD25+Treg細胞的(de)産生(shēng)需要(yࣙo)TCR與胸腺皮質上(shàng)皮細胞的(deδ÷♥&)MHC II類分(fēn)子(zǐ)間(jiān)的(<✔de)高(gāo)親和(hé)力作(zuò)用←><(yòng)，MHC II類分(fēn)子(zǐ)缺陷的(de)小(xiǎo)鼠缺乏C€✘εD4+CD25+Treg細胞。CD4+CD25+Treg細胞除了(le)在胸腺産生(s♠®®'hēng)以外(wài)，還(hái)可(kě)以在未成®γ熟的(de)樹(shù)突狀細胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低(dī)劑δ←££量抗原誘導下(xià)由外(wài)周CD4"‍β+CD25-細胞轉變而來(lái)，該類細胞稱為(wèi)誘導的(de)CD₹♦4+CD25+Treg細胞。

3、Treg細胞的(de)常用(yòng)的(de)分(fēn)子<≈(zǐ)标記

　　①CD25：Treg細胞調節機(jī)體(tǐ)免疫←€‌系統平衡，增加免疫耐受。研究表明(míng)，多(duō)種T細胞分(fēn)子(zǐ)抗原參與T£✘βreg細胞的(de)特異性功能(néng)效應。傳統鑒‌<定Treg細胞主要(yào)是(shì)通(tōng)過CD&↔↓↕4和(hé)CD25來(lái)标記。但(dàn)随著(zhe)研究的(de)進一(yī)步深入，→>發覺隻通(tōng)過CD4+CD25+雙陽性來(∑™>→lái)定義的(de)Treg細胞并不(bù)完全準确。

②FOXP3： FOX(forkhead box)是(shì)脊椎動物(wù)叉•£↑λ頭樣轉錄因子(zǐ)的(de)總稱，是(shì)一(yī)個(gè)具有∞∏™(yǒu)多(duō)種功能(néng)的(de)轉錄因子(zǐ)大(dà)家(★✘★πjiā)族，通(tōng)常和(hé)細胞生(shēng∞★↑α)長(cháng)發育的(de)調控有(yǒu)關。FOX家(jiā)族成員(y®∞uán)都(dōu)有(yǒu)一(yī)個(gè)叉頭樣結構域，能(néng)與DNAβ♦₩ 結合。FOXP3是(shì)叉頭樣轉錄因子(zǐ)家←'(jiā)族中的(de)成員(yuán)，2001年(niánγ←★)由Brunkow等首次報(bào)道(dào)。研究發現(xià→☆n)，它的(de)表達及功能(néng)與調節性T細胞(r✘•​egulatory T cells，TR細胞)密切相(x↑‌Ω<iàng)關。如(rú)果FOXP3基因發生(shēng)突變，将影≤ γ(yǐng)響TR細胞的(de)發育成熟，導緻IPEX綜合征(immune ←β÷γdysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，Xφ₽-linked syndrome)。

　　FOXP3主要(yào)表達于胸腺、脾髒和(h&¶↕'é)淋巴結等淋巴器(qì)官和(hé)組織。 ☆γ×在小(xiǎo)鼠特異性表達于CD4+CD25+T細胞，而不(bù)表達于CD8∏☆ +T細胞。在人(rén)類FOXP3不(bù)僅可(kě)表達于CD4+C">≈D25+T細胞，還(hái)可(kě)表達于CD8+CD28-T細胞。但(dàn)在CD4↑₽+T細胞中的(de)表達明(míng)顯高(gāo)于CD8+T細胞。目前，Foxp3(fo∑≠∏rkhead box P3，Scurfin)是(shì)目前∏→↔‌公認的(de)Treg細胞的(de)最敏感的(de)标志(zhì)。

③CD127：最近(jìn)發現(xiàn)通(tōng)過表達CD4，CDα"25和(hé)傳導信号FoxP3來(lái)定義調節性T細胞時(shí)，在一(yī)類£★™✔特殊的(de)細胞群體(tǐ)時(shí)會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。我β £↓們發現(xiàn)IL-7受體(tǐ)（CD127）在外(wài)周血CD4+Tγ≥的(de)一(yī)個(gè)亞群中會(huì)下(xi→ à)調表達。我們證實這(zhè)些(xiē)細胞FoxP3陽性，且這(zhè)群細₩←©胞包括那(nà)些(xiē)CD25弱陽性或陰性群體(tǐ)。聯合使用(yòng)　　CD4，CD→≤ ¶25和(hé)CD127可(kě)得(de)到(dào)高(gāo)純度的(de)調節性±"₹T細胞，比以前的(de)通(tōng)過其他(tā)标志ε←γ(zhì)物(wù)來(lái)區(qū)分(fēn)方法顯著提高(gāo)。這(zhè©≠♠♠)些(xiē)細胞在功能(néng)抑制(zhì)實驗中可(kě)發揮高(§' gāo)度抑制(zhì)功能(néng)。實際上(shàng)，通(tōng¥÷≠)過CD4和(hé)CD127表達來(lái)區(qū)分(fēn)的(de)細胞數§♣ ¶(shù)量（包括CD25+CD4+和(hé)CD25-CD4+）三倍∑$于通(tōng)過CD4+CD25hi區(qū)分(f¥​ēn)的(de)調節性T細胞亞群。最後，我們使用(yòng)CD127定量檢測I型糖尿<≈★病病人(rén)調節性T細胞，發現(xiàn)CD127可(kě)作™¶(zuò)為(wèi)人(rén)調節性T細胞的(de)标志(zhì)物(wù)。

4、FOXP3流式檢測方法

　　美(měi)國(guó)eBioscience公司是(s☆•hì)最早擁有(yǒu)FOXP3流式檢測抗體(tǐ)的(de)公司之一(yī)，公司通(t∏✘ōng)過不(bù)斷改進和(hé)優化(huà)，建立了(le)一(→↑≥↓yī)套完美(měi)的(de)針對(duì)FOXP3流式☆→檢測特殊的(de)試劑和(hé)方案。

（1）實驗材料

實驗設備

1) 流式上(shàng)樣管 

2) 混勻振蕩器(qì)

3) 離(lí)心機(jī)

4) 移液器(qì)、Tips

5) 流式細胞儀

所需試劑 

1) 細胞表面染色的(de)熒光(guāng)标記的(de)單抗試劑（CD4®↑¶、CD25或CD8等）

2) FOXP3熒光(guāng)标記抗體(tǐ)

3) 溶血素：（eBioscience目錄号00±§×-4333）用(yòng)于裂解紅(hóng)細胞

4) 淋巴細胞分(fēn)離(lí)液：若樣品為(wèi)人(rén)的(de)全血λ₩，建議(yì)先用(yòng)分(fēn)離(lí)液分(fēn)離(lí)出單個(gè)核細胞後™$再做(zuò)後續檢測

5) 固定劑和(hé)破膜劑：（eBioscience FOXP3檢測專λσ≠用(yòng)試劑，目錄号為(wèi)00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，∏☆将其中的(de)Fixation/Permeabilization Conceα✔>ntrate和(hé)Fixation/Permeabilizatio£Ω&Ωn Diluent以1：3的(de)比例混合，配制(zhì)好(hǎo)∞©的(de)溶液保存時(shí)間(jiān)不(bù)要(yào)超過一(yī)天） "

6) 其他(tā)試劑：Flow Cytometry Ω✔₽ Staining Buffer（00-422Ω¥€≠2）或PBS，Permeabilizatio≤≈φδn Buffer（Cat.No 00-8333）等

（2）實驗操作(zuò)步驟

注：對(duì)于不(bù)同的(de)FOXP3克隆号抗體(tǐ)，在操®×↔作(zuò)上(shàng)可(kě)能(néng)存在著(↕'¥→zhe)一(yī)些(xiē)細微(wē☆÷δi)的(de)差别。具體(tǐ)實驗時(shí)，請(qǐng)參考相(xiàng)應的(♠β§de)抗體(tǐ)說(shuō)明(mí≤λδng)書(shū)上(shàng)的(de)操作(zuò)步驟。此操作(zuò​♦)以人(rén)Foxp3 (clone PCH101λπ, cat. XX-4776).為(wèi)例。

1、按照(zhào)流式樣品要(yào)求制(zhì)備單細胞懸液。

2、按照(zhào)流式表面染色方法标記CD3和(hé)CD4。緩沖液洗滌一(yī)γγ♦次，離(lí)心完全棄上(shàng)清。斡旋分(♥✔fēn)散細胞。

3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabili<'☆zation 工(gōng)作(zuò)液，斡旋固定細胞。室溫或∞ 四度避光(guāng)孵育30-60min（小(xiǎo)鼠樣品最長(ch∏↔☆αáng)可(kě)以四度固定18小(xiǎo)時(shí)）。

4、每管加2ml 1×permeabilization buff©₽er。

5、300g 室溫離(lí)心5min,棄上(shàng)清。

6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。<₽β 

7、300g 室溫離(lí)心5min,棄上(shàng)清。

8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞後，加入二抗FOXP∞↓δ¥3 （或其他(tā)胞內(nèi)抗原抗體( "tǐ)），室溫避光(guāng)孵育20min。

9、2ml 1×permeabilizatio∑σn buffer洗一(yī)次，300g 室溫離(lí)心5min,棄上(shàng)清。

10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離(lσ>​δí)心5min,棄上(shàng)清。

11、适量流式染色液重懸，即可(kě)上(shàng)機(jī)檢測。同行(xíng)對(dλφ"uì)照(zhào)依照(zhào)上(shàng)述步驟進≤↕行(xíng)。軟件(jiàn)分(fēn)析結果。

　　注：在染胞內(nèi)或胞核內(nèi)的(de)因子(zǐ)時(shí)，要(yàπ€o)對(duì)細胞進行(xíng)固定和(hé)破膜，因此，與活細胞相(xiàng)比，在形∑↑α 态上(shàng)會(huì)有(yǒu‌<)一(yī)定變化(huà)，因此必須對δ✔↔★(duì)所有(yǒu)細胞樣本進行(xíng) ∏↓固定和(hé)破膜；若對(duì)Blank和(hé≈&↔§)染色細胞沒做(zuò)固定和(hé)破膜，在FSC/SSC圖中對(du ₽ì)固定和(hé)破膜的(de)樣品細胞圈門(mén)時← (shí)需要(yào)做(zuò)一(yī)定調整。