——以human IL-6 instanβ&×₩t ELISA為(wèi)例（cat#BMS213INST）

注意事(shì)項：

1. 試驗中使用(yòng)特定試劑盒的(de)标準品和(™∞×hé)抗體(tǐ)，不(bù)建議(yì)不(bù)同試劑盒産品調換，因為(wèi)可(k‍>β∞ě)能(néng)影(yǐng)響結果準确性。

2. 稀釋用(yòng)的(de)緩沖液≠☆中不(bù)能(néng)含有(yǒu)疊氮化&<₩≥(huà)鈉，因為(wèi)其可(kě)以滅活辣根過氧化(huà)物(wù)酶。

3. 儲存或孵育時(shí)避開(kāi)強光(guāng)。

4. 注意人(rén)員(yuán)防護，避免試劑接觸皮膚。

5. 底物(wù)溶液避免接觸氧化(huà)劑和(hé)金(jīn)屬。

6. 底物(wù)使用(yòng)前請(qǐng)平衡至室溫。

7. 緩沖液稀釋後有(yǒu)效期為(wèi)一(yī)個(gè)月(yuè)。

儲存和(hé)穩定性說(shuō)明(míng)

1. 試劑盒提供凍結的(de)标準品，對(duì)照(zhào)幹粉和(hσ≥é)平闆，收到(dào)後請(qǐng)立即凍存于-20度冰箱，有(y®‍γ×ǒu)效期見(jiàn)标簽。

2. 重複使用(yòng)試劑請(qǐng)避免污染。¥♥

樣品及收集注意事(shì)項

1. 本試劑盒适用(yòng)血清和(hé)細胞培養上λ‍λ★(shàng)清。

2. 取血清時(shí)注意凝結後立即取出血清凍存于-20攝氏₹λβ度一(yī)下(xià)，避免IL-6活性降低(dī)。

3. 樣品出現(xiàn)沉澱請(qǐng®®₹)離(lí)心去(qù)除，避免影(yǐng)響實驗結果。

4. 嚴重溶血或高(gāo)血脂樣品不(bù)能(néng)使用(yòng©≈​£)。

5. 避免樣品反複凍融，使用(yòng)前平衡至室溫，小(xi♥ε ǎo)心混勻。

實驗材料：

1) 預包被human IL-6抗體(tǐ)的(de)微(wēi★♣)孔闆+結合生(shēng)物(wù)素的(de)檢測抗體(tǐ)+抗↕≤生(shēng)物(wù)素的(de)辣根過氧化(huà)物(wù¶ )酶。+Human IL-6标準曲線。

2) 25ml 濃縮wash buffer 20×。

3) 12ml樣品稀釋液。

4) 15ml TMB底物(wù)(四甲基聯苯胺)。

5) 15ml 終止液：1M H3PO4 或者2N H2SO4

6) Control high 一(yī)瓶（凍✘₩‍§幹粉）。

7) Control low 一(yī)瓶（凍幹粉）。

8) 封口膜。

儀器(qì)

吸管和(hé)單通(tōng)或多(duō)通(tōng)移液器(qì)₩γ

冰箱

排槍取液水(shuǐ)槽

酶标儀

洗闆機(jī)

準備試劑和(hé)樣品

1) 将濃縮洗液（20×）平衡至室溫，稀釋為(wèi)1×。

2) Control 幹粉處理(lǐ)：加300‍δ"ul 雙蒸水(shuǐ)小(xiǎo)心重懸幹粉10~3¥"0min，使其完全溶解，使用(yòng)前請(qǐng)小(xiǎo)心混勻。按照(zhào)C ↔∑of A 處理(lǐ)control 範圍÷‌±，重懸後的(de)液體(tǐ)儲存于-20攝氏÷₽度，避免反複凍融。

實驗流程：

注意：

★ 從(cóng)-20℃冰箱取出闆子(zǐ)後立即使用(‍<yòng)，防止變質。

★ 小(xiǎo)心除去(qù)standard孔膜，是(shì)凍★™幹粉沉在底部，避免膜帶走幹粉。

★ 加入雙蒸水(shuǐ)後無需等待其完全溶解即可(kě)進行(xíng™¥&)下(xià)一(yī)步實驗。

★ 嚴禁用(yòng)TIP頭混勻孔內(nè☆"Ωi)溶液，因為(wèi)會(huì)沾走試劑影(yǐng)響結果。

★ 400ul洗液洗闆，洗滌除去(qù)孔壁粘附的(de)殘↔‌留物(wù)，以免影(yǐng)響實驗結果。

1 按照(zhào)試驗計(jì)劃準備孔闆A1/ γ♦$A2¬~H1/H2（如(rú)表1）。

2 按照(zhào)标簽所示，向standard 和(hé)blank孔加入50ulε$（标簽所示）雙蒸水(shuǐ)(A1/A2¬~H1/H2)。

3 向樣品孔中加入100ul 雙蒸水(shuǐ)。

4 向樣品孔加入樣品25ul ，包括複孔，小(xiǎo)心混勻。

5 封口膜封闆，室溫（18—25攝氏度）孵育2小(xiǎo)時(shí)，200rpm‌©♥，震蕩（若不(bù)震蕩所得(de)的(de)OD®<值可(kě)能(néng)偏低(dī)，但(dàn)是(shì↔★‌↓)仍然可(kě)用(yòng)）。

6 棄掉液體(tǐ)，加400ul洗液，15s左右‍>>，棄掉排幹，重複3次（避免孔過于幹燥）。

7 向各孔加TMB底物(wù)100ul，室溫避光(guāng)孵育10min，觀察顯色最佳≥•時(shí)間(jiān)（标準品最高(gāo)濃度變為(wèi)深藍ε‌ε(lán)色或陽性對(duì)照(zhào)不(bù)再有(yǒu)變化(huà)的(de)時(s © hí)候）。

8 迅速加入100ul 終止液終止酶反應™¥'↓，2~8度避光(guāng)1h內(nèi)檢測讀(dú)闆。

結果計(jì)算(suàn)：（需要(yào)從(cóng)标準品OD值拟合出來(lái$©≥)方程來(lái)推算(suàn)樣品的(de)細胞因子(zǐ)的(de) ×π∞含量）。

1. 計(jì)算(suàn)标準品，空(kōng)白λ↓≠(bái)和(hé)樣品孔平均OD值。

2. 樣品OD值減去(qù)空(kōng)白(bái)孔平均OD值。

3. 利用(yòng)軟件(jiàn)拟合出4參數(shù)的(de)對(d α ×uì)數(shù)标準曲線，也(yě)可(kě)以使用(yòng)描點的(de↔§)方法在坐(zuò)标中描繪出X軸為(wèi)标準品濃度，Y軸為(wèi)平均O∑<  D值的(de)各個(gè)點，然後大(dà)緻拟合出相(xiàng)應的(de)曲線。≤ 最佳的(de)方法是(shì)使用(yòng)回歸分(fēn)析的(de)方法拟合π♦₩≥出标準曲線。

4. 利用(yòng)标準曲線拟合的(de)公式去(qù)計(jì)算(suàn)樣品✘≠✔中細胞因子(zǐ)的(de)濃度。

5. 如(rú)果在實驗前樣品經過稀釋，則結果需要(yào)乘于稀釋倍數(shù)。