注意：試劑盒組成和(hé)緩沖液制(zhì)備、稀釋及儲存條件(jiàn)請(qǐng)參考♣®試劑盒說(shuō)明(míng)書(shū)，本方案不β±€(bù)在贅述。

實驗方案一(yī)

A． 樣品制(zhì)備

貼壁細胞

1. 小(xiǎo)心除去(qù)細胞培養基，用(yòng)PBS洗滌細胞一(yī•₽∞)次，若細胞培養于96孔闆，加入100ul新鮮配制(zhì)的(λ$‍de)1x Cell Lysis Mix 裂解細胞，300☆♣∏轉/min 室溫震蕩裂解10min。

注意：裂解液體(tǐ)積需要(yào)依據裂解物(wù)濃度調整。一(yī)般裂解物(wù)中蛋>φ>白(bái)含量在0.1—0.5mg/ml就(jiù)足夠實驗檢測。但(dàn)是(shì)δ£σ制(zhì)備高(gāo)濃度的(de)裂解物(wù)有(yǒu)¥←'β利于檢測出低(dī)豐度的(de)靶蛋白(bái)。

非貼壁細胞

1. 300g 5min離(lí)心出去(qù)培養基，用(yòng)Pλ BS洗滌一(yī)次，然後使用(yòng)含有(yǒu)5%的(de)H≈≈÷BSS或PBS重懸細胞，調整細胞密度（10000-25000 cells/well）确保≠£∞能(néng)裂解後蛋白(bái)濃度在0.1£€"♠—0.5mg/ml。

注意：檢測時(shí)避免用(yòng)培養基重懸細胞，因為(wèi)培養基中一(yī)些₽>(xiē)成分(fēn)可(kě)能(néng)會(huì)幹擾實驗結果。例如(rγ×α ú)RPMI1640中含有(yǒu)生(shēng)物(wù)素會(huìε₽$π)對(duì)結果造成影(yǐng)響。

2. 【可(kě)選】将細胞置于37度培養箱¥∞₩↔培養1-2小(xiǎo)時(shí)。（一(y×★α≤ī)些(xiē)信号通(tōng)路(lù)需要(yà↔★÷αo)激活細胞才能(néng)檢測到(dào)）

3. 向細胞懸液中加入終體(tǐ)積20%的(de)5X Ceσ₩ll Lysis Mix, 300轉/min 室溫震蕩裂解10min。或者離(lí)ε←心棄上(shàng)清用(yòng)1x ←§σ<Cell Lysis Mix重懸裂解細胞。

B． 檢測方案 

1. 向檢測孔中加入50ul陽性對(duì)照(zhào)、5™×₩0ul的(de)1x Cell Lysis Mix作(zu‍'ò)為(wèi)陰性對(duì)照(zh÷×★Ωào)和(hé)50ul樣品裂解物(wù)。

2. 向檢測孔加入50ul/well 預先配置的(de)antibody cock±∞tail ,小(xiǎo)心封闆，室溫震蕩孵育1h。

注意：檢測試劑使用(yòng)前要(yào)平衡至室溫。≈↑"

3. 200ul/well 洗液洗滌3次，最φδ後一(yī)次吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)排幹。

4. 向每孔加入100ul Detection Reagent 室溫≤$€孵育10-30min。根據顯色來(lái)調整時(shí)間σ"(jiān)，高(gāo)豐度顯色快(k€β®uài)，低(dī)豐度顯色慢(màn)。

5. 每孔加100ul終止液終止。

6. 終止後一(yī)小(xiǎo)時(shí)$±γ∏內(nèi)450nm酶标儀讀(dú)闆。

實驗方案二

本方案适用(yòng)于在InstantOn↑σ€ e 裂解細胞進行(xíng)實驗，也(yě)就(jiù)是(shì)ALL-In-One-Well$§×。

A. 樣品制(zhì)備

1. 離(lí)心收獲細胞用(yòng)1XPBS+5%BSA調整細胞濃度使♣×​10000-25000cells in 20ul（足夠許多(dβ♣✔uō)細胞系使用(yòng)）。注意：檢測時(shí)避免用(★☆yòng)培養基重懸細胞，因為(wèi)培養基中一(yī)€¶★些(xiē)成分(fēn)可(kě)能(néng)會(huì)幹擾實驗 €α結果。例如(rú)RPMI1640中含有(yǒu)生(shēng)σ<®物(wù)素會(huì)對(duì)結果↔± 造成影(yǐng)響。

2. 計(jì)算(suàn)使用(yòng)Instan♥÷ tOne闆條數(shù)目，安排實驗孔布局。

3. 使用(yòng)200ul/well無菌蒸餾水(™ shuǐ)洗滌闆孔兩次，出去(qù)空(kōng)內(nèi)防腐劑$↕★。

4. 向孔中加入20ul細胞懸液。【可(kě)選】将細胞置于37度培養箱培養1-2小(xiǎo)時£₩₹(shí)。（一(yī)些(xiē)信号通(tōng&ε)路(lù)需要(yào)激活細胞才能(néng)檢測到(dào)）

5. 按照(zhào)實驗設計(jì)不(bù)同時(shí)間(ji☆‌βān)點，每孔加入20ul 處理(lǐ)劑（例如(rú)2X激動劑或拮抗劑）。此外(wài)，₩♥ ¥避免使用(yòng)培養基。

6. 直接加10ul 5x Cell Lysis Mix 300轉/min 室溫‌© ×震蕩裂解10min。

B. 檢測方案

1. 向檢測孔中加入50ul陽性對(duì)照(zhào)、50ul的 "∏(de)1x Cell Lysis Mix作(σ§zuò)為(wèi)陰性對(duì)照(zhà♣↕o)。

2. 向檢測孔加入50ul/well 預先 φ≥配置的(de)antibody cocktail ,小(xiǎo)心封闆，★αα→室溫震蕩孵育1h。a) 注意：檢測試劑使用(yòng)前要₩©‌&(yào)平衡至室溫。

3. 200ul/well 洗液洗滌3次，>•₽✔最後一(yī)次吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)排幹。

4. 向每孔加入100ul Detection Reagent 室溫孵育1Ω Ω©0-30min。根據顯色來(lái)調整時(shí)間(jiā"★n)，高(gāo)豐度顯色快(kuài)，低(dī)豐度顯色慢(màn)。

5. 每孔加100ul終止液終止。

6. 終止後一(yī)小(xiǎo)時(shí)內(nèi)£€←↑450nm酶标儀讀(dú)闆。