（以BMS606 mouse IFN-gamma EL♦£ISA為(wèi)例）

注意事(shì)項：

1. 試驗中使用(yòng)特定試劑盒的(de)标準★®∞品和(hé)抗體(tǐ)，不(bù)建議(yì)不(bù)同試劑盒産品φ→'‌調換，因為(wèi)可(kě)能(néng)影(yǐng)響結果準确性。

2. 稀釋用(yòng)的(de)緩沖液中不(bù)能(néng)含有(yǒu)疊氮化(huφβ→à)鈉，因為(wèi)其可(kě)以滅活辣根過氧化(huà)物(wù)酶∏♥₹。

3. 儲存或孵育時(shí)避開(kāi)強光(guān​εg)。

4. 注意人(rén)員(yuán)防護，避免試劑σ"€接觸皮膚。

5. 底物(wù)溶液避免接觸氧化(hu"∑♠à)劑和(hé)金(jīn)屬。

6. 底物(wù)使用(yòng)前請(qǐng)平衡至室溫。

7. 緩沖液稀釋後有(yǒu)效期為(wèi)一(yī)個(gè)月(yuè)，放(fàng)大Ω↑♥ (dà)液現(xiàn)用(yòng)現(xiàn)配（配好(hǎo)立即加到(dào)∞↑闆子(zǐ)中）。

儲存和(hé)穩定性說(shuō)明(míng)

1. 試劑盒提供凍結的(de)标準品，對(duì)照(zhào)幹粉φ×→&和(hé)平闆，收到(dào)後請(qǐng)存于4~8"↑♦ 度冰箱，有(yǒu)效期見(jiàn)标簽。

2. 重複使用(yòng)試劑請(qǐng)避免污染。

1. 本試劑盒适用(yòng)血清和(hé)細胞培養上(shàng)清。

2. 取血清時(shí)注意凝結後立即取出血清凍存于-20攝>↑​氏度一(yī)下(xià)，避免IFN-gamma活性降低(dī)。

3. 樣品出現(xiàn)沉澱請(qǐn‌↔™g)離(lí)心去(qù)除，避免影(y←↓♦₹ǐng)響實驗結果。

4. 嚴重溶血或高(gāo)血脂樣品不(bù)能(néng)使用(yòng)。

5. 避免樣品反複凍融，使用(yòng)前平衡至室溫，小(xiǎo)心混勻。

試劑準備：

1. 1×Washing buffer：5∑↓×0ml 20×washing buffer concentrate+950ml ddH2OΩ→ 混合均勻，4~25攝氏度保存一(yī)個(gè)月(yuè)★ ☆。

2. Assay buffer 用(yòng)水(shuǐ)稀釋為(wèi↔σλ$)1×。

3. 用(yòng)1×assay buffer 稀釋biotin-檢測抗體(tǐ)100：1.​ε×♦

4. 用(yòng)1×assay buffer 稀釋streptavidin-HRP 100:1®λ∏₩

标準品稀釋（如(rú)下(xià)圖）

1. 按照(zhào)C of A說(shuō)明(m♥σσíng)使用(yòng)無菌雙蒸水(shuǐ)配制(zhì)濃度為(wèi)2ng↕‍ε™/ml 的(de)标準品溶液，四度平衡混勻10—30min。

2. 使用(yòng)1xAssay Buffer按如(rú)下(xià)方案稀₩∏÷&釋（1：2）

小(xiǎo)心混勻，終濃度為(wèi)1000pg/ml.

3. 在ELISA闆子(zǐ)中從(cóng)A1和(hé)A2開(₹↔₩‌kāi)始到(dào)H1和(hé)H2每孔分(fēn)别加入100ul檢測稀釋液。

4. 取100ul的(de)濃度為(wèi)2000pg/ml的(de)标準品加入到∞$(dào)A1和(hé)A2兩個(gè)孔中。

5. 用(yòng)排槍從(cóng)A1和(hé)A2兩個(gè)孔中吸取®σφ100ul加入到(dào)對(duì)應的(de)B1和(hé)B2中，吹吸混合均勻，那(nà)麽↑≠ B1和(hé)B2标準品濃度為(wèi)500pg/ml。

6. 從(cóng)B1和(hé)B2中吸取1<ε00ul加入到(dào)C1和(hé)C2孔中，混勻‍↓λ，那(nà)麽C1和(hé)C2孔标準品濃度為(wèi)250pg/ml。

7. 按照(zhào)步驟4和(hé)5的(de)方法倍比稀釋到(dàδπ∏o)G1和(hé)G2兩孔。G1和(hé)G2孔±π☆中标準品的(de)濃度是(shì)15.6pg/ml，體(tǐ)積為(wèi)225ul。

注意：4到(dào)6步驟稀釋速度要(yào)快(k☆"™‌uài)，避免時(shí)間(jiān)過長(cháng)，建議(yì)使用(yòng&✔ )多(duō)通(tōng)道(dào)排槍進行(xíng)。

8. 設置H1和(hé)H2為(wèi)空(kōng)白(bái)對(duì)照(zh​↓→ào)（隻加100ul稀釋液），為(wèi)≠↑了(le)避免胡克效應的(de)影(yǐng)響，我們建議(yì)可(kě)以采用(y‌ ✘òng)A1和(hé)A12作(zuò)為(wèi)空(α∑kōng)白(bái)對(duì)照(zhào)孔，而不(bù)設置樣品或标準∞↕★$品。

實驗材料：

1. 鋁鉑包預包被mouse IFN-抗體(tǐ)的<ελ(de)ELISA闆。

2. 100ul結合生(shēng)物(wù)素的(de)anti-mouse IFN-檢測抗體 €≈π(tǐ)。

3. 2瓶mouse IFN-标準品幹粉，2ng/ml以上(shàng£±¶)濃度重懸。

4. 10×ELISA包被緩沖液。

5. 1瓶12ml樣品稀釋液。

6. 1瓶檢測濃縮液（20X）5ml（1☆× XPBS+1%Tween20+10%BSA）。

7. 1瓶濃縮洗液（50ml,20X,1XPBS+1%Tween20）

8. 1瓶底物(wù)（15ml）

9. 1瓶終止液（15ml,1M 磷酸）

10. 封闆膜

11. 藍(lán)色、綠(lǜ)色和(hé)紅(hóng)色三瓶染料（♥♥♥←各0.4ml）

儀器(qì)

1. 吸管和(hé)單通(tōng)或多☆>(duō)通(tōng)移液器(qì)

2. 冰箱

3. 排槍水(shuǐ)槽

4. 分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(©$jì)

5. 洗闆機(jī)

實驗流程：

注意：孵育時(shí)間(jiān)和(hé)洗滌次數(shù)請(qǐng)嚴格按照(zhà‌♥®$o)說(shuō)明(míng)書(shū)執行(xíng)，不(bù)©✔←₩得(de)随意更改。

放(fàng)大(dà)液要(yào)使用(yòng)之前現(xiàn)配先用(yòng)，不∏≠ε(bù)得(de)預先配置，洗滌效果對(duì)結果至關重要(y→∞ào)。

1. 取出闆子(zǐ)，安排樣品，标準品排布順序。

2. 用(yòng)400ul1×洗液洗滌ELISA闆子(zǐ)兩次，每次10↕♣™λ—15s(小(xiǎo)心不(bù)得(de)抓闆孔表面，洗滌間(jiān)歇不(bùε©)得(de)過大(dà)，不(bù)能(néng)使闆孔晾幹)。

3. 按下(xià)圖稀釋标準品(在培養闆中&≠↕€稀釋)。

4. 加100ul樣品稀釋液至H1，H2孔≈​Ω中。

5. 加50ul 樣品稀釋液到(dào)樣品孔中，加50ul樣品到(dào)樣品∞>✔孔中。

6. 準備生(shēng)物(wù)化(huà)抗體(tǐ)€€₩（檢測抗體(tǐ)），所有(yǒu)孔中各加50ul，封闆室溫（18-25攝氏γ$'度）震蕩(100rpm/min)孵育2h。

7. 準備抗生(shēng)物(wù)素的(de)HRP，棄掉闆子(zǐ)中★‌★≠液體(tǐ)，并用(yòng)洗液洗滌3次。

8. 向所有(yǒu)孔中個(gè)加100ul稀釋好(hǎo)的(de)HRP，封÷₹​≤闆室溫（18-25攝氏度）震蕩(100rpm/mσ"±in)孵育1h。

9. 棄掉闆子(zǐ)中液體(tǐ)，并用(yòng)★ 洗液洗滌3次，向所有(yǒu)孔中個(gè)加100ulTMB底物(wù)。封€↔©闆室溫（18-25攝氏度）孵育10-20m₽Ω♥>in，每孔加100ul終止液。

10. 450nm讀(dú)闆。

結果計(jì)算(suàn)：（需要(yào)從(cóng)标準品OD值拟合出來(lái)方程來(lái)™​‌☆推算(suàn)樣品的(de)細胞因子(zǐ)的(de)含量）‌σ ♣。

1. 計(jì)算(suàn)标準品，空(kōng)白(bái)和(h™φé)樣品孔平均OD值。

2. 樣品OD值減去(qù)空(kōng)白(bái)孔平均OD值。

3. 利用(yòng)軟件(jiàn)拟合出4參數(shù)的(de)對(δ∑duì)數(shù)标準曲線，也(yě)可(kě)以使用(yòng)描點的(de)方法在↕ 坐(zuò)标中描繪出X軸為(wèi)标準‌÷​品濃度，Y軸為(wèi)平均OD值的(d×↑>♣e)各個(gè)點，然後大(dà)緻拟合出相(xiàng)應的(de)曲線。最佳的(de)✔↕ ≤方法是(shì)使用(yòng)回歸分(fēn)析的(de)方法拟合  出标準曲線。

4. 利用(yòng)标準曲線拟合的(de)公式去(qù)計(jì)算(suàn)λ¶樣品中細胞因子(zǐ)的(de)濃度。

5. 如(rú)果在實驗前樣品經過稀釋，則結果需要(yào)乘于稀釋倍數(shù €'→)。