ELISPot操作(zuò)流程：

1. ELISPOT包被

2. 每孔加 入20μl的(de)70％乙醇預濕PVDF膜、甩幹。用(yòng)無菌PBS洗☆±滌，每孔加入100μl， 洗滌2次去(qù)除乙醇。用(yòng)滅菌PBS稀釋包被抗$ δβ體(tǐ)，每孔加 入100μl已稀釋好(hǎo)的(de)包被抗體(¶♥ ÷tǐ)(終濃度10μg/ml)到(dào)各實驗孔。4°C包•÷×≥被過夜或室溫包被2小(xiǎo)時(shí)。

2. 封閉

傾倒包被液，用(yòng)無 菌PBS洗滌3次。最後一₽♦‍∏(yī)次，在滅菌的(de)吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)扣幹。每孔加入2∑λ00μl細胞培養液封閉，室溫孵育1小(xiǎo)時(shí✔÷¥§)。

3. 細胞培養

傾倒封閉液，須洗滌，直接加入準備好(hǎo)的(de)細胞。（初次進行(x'≥₹¶íng)試驗，應作(zuò)刺激物(wù)濃度梯度、和(hé)∕或細胞計(jì)數(shù∏✘≤₽)梯度預實驗）實驗組孔加入細胞和(hé)刺激物λ'¶(wù)，陽性對(duì)照(zhào)組每孔 加入10μl PHA（PHA終濃度1-4€♠¶ug/mL），陰性對(duì)照(zhào)組每孔隻加細胞。37°C二氧化(huà)碳培養箱中§₹↔培養16-24h。

4. 檢測

用(yòng)PBS/0.05%Tween-20 洗闆3次。 甩幹, 用(yòng)抗體(t>"♦ǐ)稀釋液（PBS＋1％BSA）稀釋檢測抗體(tǐ)。每孔加入1：1000稀釋好(hǎo)的(dεγ∑ e)生(shēng)物(wù)素記檢測抗體(t♦☆∏ǐ)100μl，室溫孵育2h。用(yòng) P♠★λ‌BS/0.05%Tween-20 洗闆3次。 甩幹, 用(yòng)抗©≤₽體(tǐ)稀釋液（PBS＋1％BSA）稀釋酶親和(hé)素 ，每孔加入1：1000稀釋好(hǎ₹&≈€o)的(de)酶親和(hé)素 ，室溫孵育1h。

5. 顯色

用(yòng)PBS/0.05%Tween-20 洗闆3次，PBS洗闆1¥™±次。拍(pāi)幹。加 入50μl BCIP·± NBT顯色液。室溫靜(jìng)置15-45min，注意避₩¶光(guāng)。

6. 終止顯色自(zì)來(lái)水(shuǐ)沖洗闆子(zǐ)，室溫幹燥後在倒置顯微αγ↑λ(wēi)鏡下(xià)觀察結果或使用(yòng)自(zì)動酶聯斑點圖像÷♣≠≥分(fēn)析儀進行(xíng)分(fēn)析。