Foxp3 染色過程　　

下(xià)面是(shì)人(rén)的λ™β(de)Foxp3用(yòng)結合Foxp3抗體(tǐ)（例如(rú) PCH或者©∑236A/E7克隆）的(de)熒光(guāng)染料進行(xíng)胞©±©☆內(nèi)染色的(de)過程。請(qǐng)參照(zhào)相(xiàng)應的(de♣≠)特異性克隆過程。小(xiǎo)鼠或者大(dà)鼠組織的(d≠‍e)染色在用(yòng)固定/透化(huà)液孵育過程時(shí)可(§≠♥ kě)能(néng)會(huì)稍 微(®&wēi)改動一(yī)下(xià)。Foxp3染色緩&∑₹∏沖液的(de)使用(yòng)是(shì)很(hěn)關鍵的(de)。　　在染色之前，應該把固定∑☆ ®/透化(huà)濃縮液按1:3的(de)比例稀釋，此緩沖液的(de)儲π₩→≠存時(shí)間(jiān)不(bù)能(néng)超過一(yī)天。例±< 如(rú)，12 份樣品，用(yòng)3 ml固定/透化(huà)濃‌ 縮液和(hé)9 ml固定/透化(huà)稀釋液。在使用(yòng)之前，​Ω10×透化(huà)濃縮液應該稀釋為(wèi)1×溶液

1． 加100 ?l 準備好(hǎo)的(de)細胞（' ₹☆1×106個(gè)/?l）加入到(dào)各個(gè£≥₽÷)試管中；

2． 染色表面分(fēn)子(zǐ)如(r₩‍↔ú)CD4、CD8、CD25等，這(zhè)個(gè)網站(zhàn)是(∞δ♦shì)表面染色過程（http://www.ebioscience.com¶★/ebioscience/appls/FCS.htm）.&↕

3． 用(yòng)冷(lěng)的(de)流式液或冷(lěng)的(de)PB₹&£×S洗滌；

4． 斡旋重懸細胞并且在每一(yī)個(gè)樣品中加入1 ml£→• 新鮮的(de)固定、透化(huà)液。再次渦旋。

5． 4 ℃避光(guāng)孵育30-♦"✘60 min；

6． 加入2 ml 1×透化(huà)液洗滌一(yī)次↕ ♦，然後離(lí)心沉澱并倒掉上(shàng)清液；

7． 用(yòng)100?l 2% 正常鼠的(de)血清4 ℃封閉15分(fēn)& &鐘(zhōng)；

8． 封閉後不(bù)用(yòng)洗，加入20 ?l 結合Foxp3抗體(tǐφγδ)的(de)熒光(guāng)染料或者同種對(du<♠ì)照(zhào)，4 ℃避光(guāng)孵育至少(shǎo)30min；®​

9． 加入2 ml 1×透化(huà)液洗滌，離(lí)心沉澱棄掉上(shàng)清；

10． 重複步驟9；

11． 用(yòng)适當的(de)流式染料緩沖液重懸細胞，然後↓¶Ω再流式細胞儀上(shàng)分(fēn)析。請(qǐng)注意β©♦由于固定和(hé)透化(huà)過程，細胞數(shù)量的(de)F≥←♠SC/SSC分(fēn)布将和(hé)活細胞不(bù)同。因此門(mén)和(÷₹hé)電(diàn)位差将會(huì)被修改。