流式胞內(nèi)蛋白(bái)染色，很(hěn)關鍵的(de)一(yī)點是(shì)需要(yàβ☆o)知(zhī)道(dào)要(yào)染的(de)蛋白(bái☆λλ©)在哪個(gè)位置，這(zhè)樣才能(néng)選對(duì★™ )操作(zuò)流程和(hé)buffer體(₩​♥tǐ)系。例如(rú)，核內(nèi)蛋白(bái)和(hé≤₩♣)大(dà)部分(fēn)分(fēn)泌蛋白(bái)要(yào)用(yòng)eBioscie≥​α∑nce 的(de)Foxp3/Transcri≥→εφption Factor Staining Buffer Set∞Ω<≥ (eBioscience Cat. No. 00-5523)，而像細胞因子(zǐ)和(•×hé)趨化(huà)因子(zǐ)這(zhè)類分(fēn)泌蛋白(bái)要(yào•Ω)用(yòng)Intracellular Fixation and Permeabi★±lization Buffer Set (eBioscience Ca€♥÷t. No. 88-8824)。對(duì)于磷酸化(huà)信号通(tōng)路(lù)蛋白≤'≤(bái)，不(bù)能(néng)用(yòng)以上(s₹≈₽​hàng)兩種buffer體(tǐ)系，而要(yào)用(yòng)Fixation/Metha⮀nol Protocol。

eBioscience針對(duì)流式胞內(nèi)≠ ≠©染色推出了(le)三種解決方案：

方案A：兩步法胞內(nèi)蛋白(bái)染色（細胞質），用(yòng)于檢測可(kě)以通(tōng)過體(tǐ)內(nèi)或體(tǐ)外(w©© ≤ài)激活的(de)單個(gè)細胞的(de)胞漿蛋白(bái)、↑÷≤細胞因子(zǐ)或其他(tā)的(de)分(fēn)泌蛋白(báiΩ₹)。

方案B：一(yī)步法胞內(nèi)蛋白(bái)染★★£色（細胞核），用(yòng)于檢測核內(nèi)蛋白(bái)，如(rú)轉錄因子(zǐ)。

方案C：兩步法Fixation/Methano✘' l，用(yòng)于檢測磷酸信号分(fēn)子(zǐ)，如(rú)MAPK和(hé)± γ÷STAT蛋白(bái)等。

注意：

1、  流式抗體(tǐ)要(yào)避光(≈★'↓guāng)儲存于2-8°C，嚴格避免反複凍融。

2、  使用(yòng)抗體(tǐ)前，快(kuài)速旋₩₩₽轉使抗體(tǐ)恢複到(dào)最大(dà)體(tǐ)積，不(bù)建議(yì)斡旋混勻抗體(tǐ•♠₽$)。

3、  除操作(zuò)說(shuō)明(míng)外(wài)，所有(yǒu)的(de‌±​)染色步驟一(yī)律在冰上(shàng)或4℃避光(guāng)操作∑' ∑(zuò)。

4、  緩沖液中加BSA或FBS可(kě)以減少(shǎσ₩§₽o)固定破膜後的(de)非特異性背景。

5、  固定和(hé)透化(huà)作(zuò)用(yò‌®ng)将影(yǐng)響eFluor納米晶體(tǐ)的(de)亮(liπ∑β>àng)度，建議(yì)使用(yòng)最短(duǎn€¶)的(de)固定和(hé)透化(huà)作(zuò)用(yòng)時(shí)間(jiān)✘♠，染色後立即上(shàng)機(jī)檢測分(fēn)析。£§

方案A: 兩步法胞內(nèi)蛋白(bái)染色（細胞質）

實驗材料：

12×75mm圓底檢測流式管。

[可(kě)選]可(kě)固定的(de)↑¶÷>活度染料eFluor®450,506,660, or 780 (eBiΩ★α₽oscience Cat. No. 65-

0863,65-0866,65-0864,65-0865)

胞內(nèi)抗原的(de)直标抗體(tǐ)。

胞內(nèi)Fixationand Permeabilization Buffer Set(eB≥φioscienceCat. No. 88-8824)，稀釋到(dào)1x使用(yòng)

Flow Cytometry Staining Bu∑≈ffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)

刺激劑：CellStimulation Cocktail (plu•©$'s protein transport inhibitors)(500X↕↕φ☆)(eBioscience Cat.No. 00-4975) or Pro λ₩teinTransport Inhibitor Cockt∏≠¶←ail(500X) (eBioscience Cat. No.00-4980) or ☆∞✘Brefeldin ASolution (eBioscienε₹§ce Cat.No. 00-4506) or Mone €nsinSolution (eBioscience Cat. No. 00-4505)

實驗流程： 

1、按照(zhào)流式樣品要(yào)求制(zhì)備單細胞懸液。

2、按照(zhào)流式表面染色方法标記細胞表面©>→抗原，緩沖液洗滌一(yī)次，離(lí)心♣↑§完全棄上(shàng)清。斡旋分(fēn)散細胞。

3、加100ul ICFixationbuffer ，斡旋固定細胞，室溫避光(guāng)孵育★±‌20-60min。

4、每管加2ml1×permeabilization buffe₹≥↔≤r，300-400xg室溫離(lí)心5mi×λ€∞n，棄上(shàng)清。

5、每管加2ml1×permeabilization bufferδ™×重懸細胞，300-400xg室溫離(lí)心5min，棄上(shàng)清。

6、每管加100ul1×permeabili¶£‍zation buffer 重懸細胞後，加入檢測胞內(nèi)抗原的(de δ)抗體(tǐ)，室溫避光(guāng)孵育20-60min。

7、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一(yī)次，300πβ-400xg室溫離(lí)心5min，棄上(shàng)清。

8、每管加2ml FlowCytometry Staining Buffer，300-400x¶‌g室溫離(lí)心5min，棄上(shàng)清。

9、每管适量流式染色液重懸即可(kě)上(§¶​$shàng)機(jī)檢測，同行(xíng)對(duì)照(zhα‌¶ào)依照(zhào)上(shàng)述步驟進行(xíng)。

方案B：一(yī)步法胞內(nèi)蛋白(bái)染色（細胞核）

實驗材料：

12×75mm圓底檢測流式管或96孔尖底或圓底微(wēi)孔闆。

[可(kě)選]FixableViability Dy©♣₽es eFluor 450, 506,660 and 78>↔∞0(eBioscience Cat. No. 65-

0863,65-0866,65-0864,65-0865)

胞內(nèi)抗原的(de)直标抗體(tǐ)。

Foxp3/Transcription Factor Staining∏φ♥ Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523)&nbs₽♦p;

Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. ←≈No. 00-4222)

實驗流程一(yī)（試管）

1、按照(zhào)流式樣品要(yào)求制(zhì)備單$≤€↔細胞懸液。

2、按照(zhào)流式表面染色方法标記細胞"γ↓表面抗原。緩沖液洗滌一(yī)次，離(lí)απ∑心完全棄上(shàng)清。斡旋分(fēn)散細胞。

3、每管加1mlFoxp3 Fixation/pe∑↑≈→rmeabilization 工(gōng)作​ (zuò)液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光(gπσ✔¥uāng)孵育30-60min（小(xiǎo)鼠樣品最長(ch $↔φáng)可(kě)以四度固定18小(xiǎo)時(shí)）。

4、每管加2ml1×permeabilizationbuffer，30☆§±0-400xg室溫離(lí)心5min，棄上(shàng)₩•←清。

5、每管加2ml1×permeabilizationbuf™↔​fer重懸細胞，300-400xg 室溫離(lí)心5min,棄上(shàng)"₩∏清。

6、每管加100ul1×permeabilizationbuffer重懸☆ε細胞。

7、可(kě)選：每管加入2ul 2%norm←​&€al mouse/rat serum 封閉，室溫孵育15分(§∑fēn)鐘(zhōng)。

8、每管加入熒光(guāng)标記抗體(tǐ)，室溫避光(guāng)孵育30mδφ♠•in。

9、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一( αyī)次，300-400xg室溫離(lí)心5min，棄上(shàng♠←×)清。

10、每管加2ml1×permeabilizationbuffer或Fl↕ ↓∏owCytometry Staining Buffer，300∑¥♠-400xg室溫離(lí)心5min，棄上(shàng)清。

11、每管加适量FlowCytometry Sta≤αining Buffer重懸細胞，即可(kě)上(s™↑γ&hàng)機(jī)檢測。同行(xíng)對(duì)照(zh₽×≤ào)依照(zhào)上(shàng)述步驟進行(xíng)。

實驗流程二（96孔微(wēi)孔闆）

1、按照(zhào)流式樣品要(yào)求制₩✘(zhì)備單細胞懸液。

2、按照(zhào)流式表面染色方法标記細胞表面抗原。緩沖液洗滌一(y✘​ī)次，離(lí)心完全棄上(shàng)₹¥₹清。斡旋分(fēn)散細胞。

3、每孔加200 µLFoxp3 Fixation/permeabilization 工(gō™§•ng)作(zuò)液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光(guāng)孵育30-60min（小 ÷(xiǎo)鼠樣品最長(cháng)可(kě)以四度固定18小(xiǎo)時(shí)）≥∞。300-400xg室溫離(lí)心5min，棄上(shà '♥®ng)清。，

4、每孔加200 µL1×permeab'σ∏ilizationbuffer，300-400xg 室溫離♠↑ε​(lí)心5min,棄上(shàng)清。

5、重複步驟4。

6、每孔加100ul1×permeabilizationbuffer重懸✔$₹細胞

7、可(kě)選：每孔加入2ul 2%normal mouse/rat "☆©§serum 封閉，室溫孵育15分(fēn)鐘(zhōng)。

8、每孔加入熒光(guāng)标記抗體(tǐ)，室溫避光(guāng)孵育30±φ‍min。

9、每孔加200 µL1×permeabilizatiπ₹×‌onbuffer洗一(yī)次，300-400xg室溫離(lí)心5mi<£→αn，棄上(shàng)清。

10、每孔加200 µL1×permeabilizationbuffer或FlowCyto&✔♠✘metry Staining Buffer，300-400xg室溫離(lí)心5∑γ♣→min，棄上(shàng)清。

11、每孔加适量Flow CytometryStaining Buffer重懸細↓ ≈胞，即可(kě)上(shàng)機(jī)檢測。同行(xíng)對(duì)照(zhào✔¶δ)依照(zhào)上(shàng)述步驟進行(xíng)。

方案C：兩步法Fixation/Methanol

實驗材料：

12×75mm 圓底檢測流式管或96孔尖底或圓底微(wēi)孔闆。

胞內(nèi)抗原的(de)直标抗體(tǐ)

eBioscienceFlowCytometry Staining B× ∞uffer (Cat. No. 00-4222)

eBioscienceICFixation ↕≈♠Buffer (cat. 00-8222)

90-100% 甲醇(HPLC 級)

可(kě)選Fc Block：Anti-Mouse CD16/CD32 PuriΩεfied(eBioscienceCat. No. 14-0161)♠ ε or Human Fc ReceptorBinding Inhibitor Purifi ↔↕™ed(eBioscienceCat. No. 14-9≤✔✘£16 ）

實驗流程

1、準備刺激細胞的(de)刺激劑，用(yòng)刺激劑重懸細胞使細胞濃±₩∞度達1-5x106cells/mL，37℃培養一(yī)段時(shí)間(jiān)（刺激時(sh&✔★í)間(jiān)依樣品而定）。取未刺激的(de)細→✔‍胞同樣處理(lǐ)作(zuò)為(wèi)陰性對(duì)照(zhào)。

2、固定細胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到(§δ≥↓dào)細胞裡(lǐ)，斡旋混勻，室溫，→♠₩✔避光(guāng)孵育10-60min。

3、室溫600xg離(lí)心4-5min，‌↑π¥棄上(shàng)清。

4、重懸細胞，加1mL冰冷(lěng)的₩ (de)90-100%甲醇，渦旋混勻，4℃或冰上(s☆$÷•hàng)孵育至少(shǎo)30min。

注意：細胞加了(le)甲醇，可(kě)以在<-20℃條件∑×<(jiàn)下(xià)保存超過4周。

5、用(yòng)FlowCytometryStainiφ₹∞εng Buffer洗滌細胞，室溫600xg離(lí)心4-5min，棄上(s↕<λhàng)清。

6、用(yòng) FlowCytometryStaining Buffer重懸細胞，将細胞濃π≤✘☆度調至1x107cells/mL 。

7、取100 μL(1x106cells)細胞到(dào)流式管。≥↔βα

8、可(kě)選：染色前可(kě)以使用(yòng)MouseC₽&$D16/ CD32抗體(tǐ)或人(rén)類Fc受體(tǐ)抑↕'€制(zhì)非特異性結合。

9、加熒光(guāng)标記抗體(tǐ)，室溫避光(guāng)孵育3≠×0-60min。

注意：如(rú)果需要(yào)，表面染色和(hé)胞內(nèi)磷酸染色可σ§®(kě)以同時(shí)進行(xíng)，因為(wèi)不(bù)是(sβΩhì)所有(yǒu)的(de)抗體(tǐ)克隆号都(dōu)結合到(dào)一​∞‍(yī)個(gè)固定位點，請(qǐng)查閱固定和(hé)甲醇處理(lǐ)後細胞染™↔色的(de)抗體(tǐ)克隆号表。

10、用(yòng)2mL FlowCytometrySta←£ining Buffer洗滌細胞，室溫600xg離(lí)心4-5min，棄≤σ上(shàng)清。重複一(yī)次。

11、用(yòng)适量的(de)FlowCytometryStaining Buff✔×er 重懸細胞後上(shàng)機(jī)檢測。同行(xíng)對(duì)照(zh€♦φ∏ào)依照(zhào)上(shàng)述步驟進行(xíng)。

實驗流程（96孔微(wēi)孔闆）

1、準備刺激細胞的(de)刺激劑，用(yòng)刺激劑重懸細胞使細胞濃度達1-5↔λx106cells/mL，

2、取96孔微(wēi)孔闆，每孔加100μL∑✔₹¥刺激劑，再加100 μL細胞，37℃培養一(yī)段時(sh∏&í)間(jiān)（刺激時(shí)間(jiān)♣←依樣品而定）。取未刺激的(de)細胞同樣處理(lǐ)作(zuò)為(wèi)陰性對(☆φε duì)照(zhào)。

3、固定細胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到(dào)細胞裡(lǐ)，斡旋ε‍≥'混勻，室溫，避光(guāng)孵育10-60min。

4、室溫600xg離(lí)心4-5min，棄上(s÷ασhàng)清。

5、重懸細胞，加1mL冰冷(lěng)的(de)90-100%♣☆甲醇，渦旋混勻，4℃或冰上(shàng)孵育至少(shǎo)30min

注意：細胞加了(le)甲醇，可(kě)以在<C的(de)條件(j↑©iàn)下(xià)保存超過4周。°-20

6、用(yòng)200 μLFlowCytometry Staining Buffer→♦® 洗滌細胞，室溫600xg離(lí)心4-5min，棄上(‌✘←Ωshàng)清。重複一(yī)次。

7、可(kě)選：染色前可(kě)以使用(yòng)Mouse 的(de)CD16/CD3∏Ω​'2純化(huà)抗體(tǐ)或人(rén)類Fc受體(tǐ)抑制(zhì)分(fēn)特異性∞÷結合。

8、加熒光(guāng)标記抗體(tǐ)，室溫避αφ光(guāng)孵育30-60min。

注意：如(rú)果需要(yào)，表面染色和(hé)©✔胞內(nèi)磷酸染色可(kě)以同時(shí)進行(xíng)，因為(wèi)不(b♣↓☆ù)是(shì)所有(yǒu)的(de)抗體★γ(tǐ)克隆号都(dōu)結合到(dào)一(y ♣§ ī)個(gè)固定位點，請(qǐng)查閱固定和ε‍(hé)甲醇處理(lǐ)後細胞染色的(d<ε£ e)抗體(tǐ)克隆号表。

9、用(yòng)2mL FlowCytometryStaining Buffer洗滌≠ε'細胞，室溫600xg離(lí)心4-5min，棄上(shàng)清。重複一(y♦÷ ī)次。

10、用(yòng)适量的(de)FlowCytometryStaining Buffer 重¶★♦¥懸細胞後上(shàng)機(jī)檢測。同行(xíng)對(d¶•"uì)照(zhào)依照(zhào)上(shàng)述步驟進行(xín↔±♥"g)。