方案A：細胞懸液的(de)表面抗原染色。

方案B：一(yī)步法胞內(nèi)蛋白(bái)染色（細胞核）。

小(xiǎo)貼士：

1、流式抗體(tǐ)要(yào)儲存于避光(guāng)4度，嚴格避免凍融。

2、流式抗體(tǐ)使用(yòng)前要(yào)離(lí)心3mi✔'n，避免貼壁蓋的(de)損失，請(qǐng)勿斡旋混勻。

3、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。

4、eFluor納米晶體(tǐ)抗體(tǐ)參照(↔↕≈βzhào)該品說(shuō)明(míng)進行(xíng)改善。

方案A: 細胞懸液的(de)表面抗原染色

實驗材料：

15×75mm圓底流式管或96孔闆

直标一(yī)抗或純化(huà)抗體(tǐ)

二抗（可(kě)選）

抗小(xiǎo)鼠CD32/16抗體(tǐ)（eBioscience Cat. No. 1→☆₽4-0161）

人(rén)FCR結合抑制(zhì)劑（eBio$πscience Cat. No. 14-9161）

流式染色液（eBioscience Cat.×₩ No. 00-4222）可(kě)自(zì)行(xíng)配制(zhì)

eFluor納米晶體(tǐ)抗體(tǐ)染色液（eBioscience →Ω↑φCat. No. 00-3222；可(kě)選）

7-AAD活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-69‌λ♣∏93）或PI染色液（eBioscienc∞∏★e Cat. No. 00-6990）

實驗流程： 

1、按照(zhào)樣品細胞制(zhì)備方案制(zhì↕¶✘)備懸浮細胞，調整濃度為(wèi)2×107/ml。

2、（可(kě)選）封閉FCR介導的(de)非特異性反應：<∑≠

小(xiǎo)鼠：染色之前加0.5ug-1≤±‌ug/100ul CD16/32抗體(tǐ)，孵育20min。

人(rén)類：染色之前加20ul 人(rén)FCR結合抑制(zhì)劑孵育2<☆"☆0min。

3、等分(fēn)細胞懸液，每管50ul，再補加50ul染色液。

4、按照(zhào)抗體(tǐ)說(shuō)明(m$  íng)書(shū)加入适量抗體(tǐ)，輕彈混勻。

5、直标抗體(tǐ)。

方案B：淋巴組織細胞制(zhì)備

實驗材料：

60×15mm 的(de)組織培養皿

[5ml 注射器(qì)

細胞過濾器(qì)（尼龍網過濾）

eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience®≤ ∞ Cat. No. 00-4222)

15ml或50ml的(de)離(lí)心管。

注意：

Foxp3 Fixation/Permeabilization Concen∑​trate 1份加3份 Diluent 稀™↑  釋為(wèi)工(gōng)作(zuò)液（1:4稀釋）。

實驗方案： 

1、按照(zhào)流式樣品要(yào)求制(zhì)©<®σ備單細胞懸液。

2、按照(zhào)流式表面染色方法标記CD3和(©Ωhé)CD4。緩沖液洗滌一(yī)次，離(lí)心完全棄上(shà>γng)清。斡旋分(fēn)散細胞。

3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilizat≈≈$•ion 工(gōng)作(zuò)液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光(guāδ♦¶ng)孵育30-60min（小(xiǎo)鼠樣品最長(cháng)可(kě)§<以四度固定18小(xiǎo)時(shí)）。

4、每管加2ml 1×permeabilization b ‍<uffer。

5、300g 室溫離(lí)心5min,棄上(£→≠∞shàng)清。

6、2ml 1×permeabilizati&¶on buffer重懸細胞。

7、300g 室溫離(lí)心5min,棄上(sβ§​hàng)清。

8、加100ul 1×permeabiliza​™↓×tion buffer 重懸細胞後，加入"×二抗FOXP3 （或其他(tā)胞內(nèi)抗φ×↑原抗體(tǐ)），室溫避光(guāng)ε§↕孵育20min。

9、2ml 1×permeabilizat↓☆ion buffer洗一(yī)次，300g 室α&≥溫離(lí)心5min,棄上(shàng)清。

10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離(lí¶•)心5min,棄上(shàng)清。

11、适量流式染色液重懸，即可(kě)上(shàng'★∏£)機(jī)檢測。同行(xíng)對(duì)照(zhào)依照(z♣±•αhào)上(shàng)述步驟進行(xíng)。軟件(jiàn)分(fēn)析結果。