流式一(yī)、

樣品的(de)準備

試驗一(yī)：組織培養細胞的(de)細胞準備

材料 　　

AccutaseTM Enzyme Cell 完全培養基（↓★<♦eBioscience Cat.No. 00-4555）　　流式 §‌細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　15或50mλ₽ $l尖底離(lí)心管

實驗過程

1． 對(duì)于懸浮培養的(de)細胞，把細胞分(fēn)裝到(dào)一(yī₩ ≤)個(gè)尖底離(lí)心管中，對(duì)細胞進行(xín₽φ↕®g)計(jì)數(shù)和(hé)活性分(fēn)析，然後進入步驟3；

2． 對(duì)于貼壁培養的(de)細胞，建議(yì &)用(yòng)AccutaseTM Enzyme Cell 完全 × 培養基從(cóng)培養皿上(shàng)吹起并吹散細胞凝聚物(wù)，然後把細胞分 β(fēn)裝到(dào)一(yī)個(gè)尖底離(lí)心管中，對(duì)細胞進行(xín♠ ≤g)計(jì)數(shù)和(hé)活性分(fēn)析，∏→↕進入步驟3；

3． 離(lí)心細胞然後用(yòng)流式細胞儀染色液重懸細胞使其終濃度為(wèi)2×1§≥§∏07個(gè)細胞/ml。

試驗二：淋巴組織的(de)細胞準備

材料　　

60×15 mm 組織培養皿　　

3 ml注射器(qì)　　

細胞濾網（血液尼龍濾網）　　

流式細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）♥↑® 　　

15或50ml尖底離(lí)心管

實驗過程

1． 采集組織（采集組織（脾，淋巴結，胸腺）放(fà∏λ♠ng)進一(yī)個(gè)細胞培養皿中，用(yòn₩×g)3 ml注射器(qì)的(de)活塞→↓®擠壓以制(zhì)成單細胞懸液，此過程用(yòng)10ml的(de)染色緩沖液；

2． 加入10ml染色液收集細胞，使細胞懸液通(tōng)過尼龍濾$↔•$網以除去(qù)成團的(de)細胞和(hé)細✔®胞碎片，收集細胞懸液于尖底離(lí)心管中；

3． 4℃離(lí)心細胞懸液4-5分(fēn)鐘(zhōng)↔∞£（300-400g），棄掉上(shàng)清液；

4． 重懸細胞沉澱，細胞計(jì)數(shù)和(hé)活性分(fēn)析；

5． 按照(zhào)步驟3離(lí)心細胞然後用( ∞δ yòng)合适體(tǐ)積的(de)染色液重懸細胞，使細胞終₹→濃度為(wèi)2×107個(gè)細胞/ml。

試驗三：非淋巴組織的(de)細胞制(zhì)備

材料　　

剪刀(dāo)或者手術(shù)刀(dāo)片　　

PBS 　　

60×15 mm 組織培養皿　　

3 ml注射器(qì)　　

細胞濾網（血液尼龍濾網）　　

流式細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　

15或50ml尖底離(lí)心管　　

實驗過程

1． 采集組織，用(yòng)剪刀(dā¥βo)或手術(shù)刀(dāo)切成2-4mm的(de)小(xiǎo)塊；

2． 按照(zhào)酶的(de)使用(yòng)說(shuō)明(mínεβ★↓g)書(shū)，加入适量用(yòng)PBS稀釋的(de)酶×₽≥★，孵育。酶的(de)選擇可(kě)以參照(zhào)以下(xià)網站(zhàn)：http:‌☆//www.tissuedissociation.com；

3． 用(yòng)移液管輕輕吹散細胞，并用(yòng)濾網過濾除去± ±(qù)成團的(de)細胞和(hé)細胞碎片；

4． 4℃離(lí)心細胞懸液4-5分(fēn)鐘(zhō®≠≈ng)（300-400g），棄掉上(shàng)清液；

5． 用(yòng)PBS重懸細胞沉澱以移除剩餘的(Ωφ'de)酶溶液；

6． 重複步驟4；

7． 重複步驟5和(hé)6；

8． 用(yòng)流式染色液重懸細胞沉澱，細胞計(jì)數(shù)和(hé✘>☆≠)活性分(fēn)析；

9． 按照(zhào)步驟4離(lí)心細胞然後用(yòng)合适體(tǐ)積的≤ε(de)染色液重懸細胞，使細胞終濃度為(wèi)2×107個(g'∏α‍è)細胞/ml。

試驗四：

材料　　

PBS 　　

FicollTM或其它的(de)培養基　　

流式細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　

15或50ml尖底離(lí)心管實驗過程

1． 在尖底離(lí)心管中用(yòng)PBS按1:1的(de)比例稀釋血樣；

2． 用(yòng)FicollTM 等倍稀釋σ↕樣品；

3． 離(lí)心20分(fēn)鐘(zhōng)；

4． 收集PBS和(hé)FicollTM交界處的(de)PBMC；±​εδ

5． 在試管中加入PBS；

6． 4℃離(lí)心細胞懸液4-5分(fēn)鐘(zhō≠→ ←ng)（300-400g），棄掉上(shàng)清液；

7． 用(yòng)流式染色液重懸細胞沉澱，™&§∞細胞計(jì)數(shù)和(hé)活性分(fēn)析；

8． 按照(zhào)步驟6離(lí)心細胞然後用(yòng)合适體<₽♠(tǐ)積的(de)染色液重懸細胞，使細胞終濃度為(wèi)2×107個(gè)細σ 胞/ml。 　　

用(yòng)淋巴組織細胞懸液在流式細胞↕‌儀上(shàng)分(fēn)析以前，最好(hǎo)去(qù)掉紅(hóng)σσ♣細胞。

試驗一(yī)：鼠脾細胞中紅(hóng)細胞的←σ(de)裂解：

材料　　

1×PBS 　　

eBioscience 紅(hóng)細胞裂解液(Cat.No.00-4333) 　　®π

50ml 尖底管

1． 采集小(xiǎo)鼠的(de)脾髒并且制(zhì)成單細胞懸液；♦‌

2． 4℃ 離(lí)心沉澱細胞（300-400g），棄掉上(sφ< ≠hàng)清液；

3． 用(yòng)5ml脾的(de)紅(♦☆₩hóng)細胞裂解液重懸細胞；

4． 室溫震蕩孵育4-5分(fēn)鐘(zhōng)（也(yě)  可(kě)在冰上(shàng)進行(xíng)）；

5． 加入20-30ml PBS 停止反應；

6． 4℃ 離(lí)心沉澱細胞（300-400g），然後 £δ 用(yòng)合适體(tǐ)積的(de)緩沖液重懸細胞沉澱，繼™→÷續下(xià)一(yī)步試驗；

7． 細胞計(jì)數(shù)。

試驗二：小(xiǎo)鼠血液的(de)紅(hóng)細胞裂©♣♦解

材料　　

1×PBS 　　

eBioscience 紅(hóng)細胞裂解液(Cat.No.00 >‍-4333) 　　

50ml 尖底管

1． 1ml小(xiǎo)鼠血液中加入10ml 紅(hóng)細胞裂解液；

2． 室溫震蕩孵育4-5分(fēn)鐘(zhōng)（也(yě)可(kě)在冰上(shà¥✘↑ng)進行(xíng)）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反應；

4． 4℃ 離(lí)心沉澱細胞（300-400g'λφ），然後用(yòng)合适體(tǐ)積的(de)緩沖液重懸細胞沉澱，繼續下(xià)一(y±¶$ī)步試驗；

5． 細胞計(jì)數(shù)。

試驗三：人(rén)外(wài)周血中紅(¥ ​hóng)細胞的(de)裂解

材料　　

1×PBS 　　

eBioscience 紅(hóng)細胞裂解液(Cat.€≠No.00-4333) 　　

50ml 尖底管

1． 1ml人(rén)的(de)血液中加入10ml 紅(hóng)細胞裂解液；

2． 室溫孵育10分(fēn)鐘(zhōng)（不(bù)®π要(yào)超過15分(fēn)鐘(zhōng)）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反應；

4． 4℃ 離(lí)心沉澱細胞（300-400g），

然後用(yòng)合适體(tǐ)積的(de)緩沖液重懸細胞沉澱，繼續下(xià)一(yī)步★§Ω試驗；

5． 細胞計(jì)數(shù)。