實驗材料：

　　Mouse, Rabbit 或Goat IgG Tru>♦$eBlot™

　　TrueBlot™ Ig IP 微(wēi)球 or Protein A 或 G 微($✘wēi)球

實驗設備：

　　SDS-PAGE電(diàn)泳及轉膜相(xiàng)關設備和(hé)緩↔♣↔&沖液；

　　微(wēi)量移液器(qì)；

　　搖床；

　　PVDF或nitrocellulose膜；

　　WB結果檢測設備及底物(wù)

實驗步驟

　　1）. 免疫共沉澱（IP）和(hé)SDS-PAGE電(diàn)泳

　　(1) 細胞裂解：往107/ml細胞中加入适量預冷(lěng)的(¥☆​←de)細胞裂解液和(hé)蛋白(bái)酶抑制(zhì)劑，混勻4度孵育30φ♦-60分(fēn)鐘(zhōng)後10000g離(lí)心15min，保•♥←留上(shàng)清液。布氏法檢測蛋白(bái)濃度∞ ≥€後，将樣品稀釋為(wèi)1μg/μl左右。可(kě)-80度凍存或繼續下(xià)一∑≠(yī)步。

　　(2) 細胞裂解物(wù)的(de)預清洗：加50ul之前用(yòng)裂解液稀釋的(de)相σ<π(xiàng)應種屬Ig IP Beads（or Protein A/ πG beads）到(dào)裝有(yǒu)500ul細胞裂解物(wù)•"‌的(de)離(lí)心管中，冰上(shàng)孵育30-6ε✘®≠0分(fēn)鐘(zhōng)；2500×g離(lí)心2-3分(fēα©n)鐘(zhōng)後把上(shàng)清液（不(bù)能(néng)帶沉澱微(wēi)球α£±γ）轉移到(dào)新的(de)離(lí)心管中。

　　(3) 免疫共沉澱：在裝有(yǒu)預清洗後的(de)細胞裂解物(wù)的(de)<←&離(lí)心管中加入1-10ug的(de)一(yī)抗 "¥☆，4°C孵育 1-2小(xiǎo)時(shí)或者ββ搖晃過夜。再加入50ul用(yòng)裂解液預處理(lǐ)過的(de →♦‍)Ig IP Beads（or Protein A/G beadsβ♣✘β），4°C混勻孵育1-2小(xiǎo)時(shí)πεπ"或搖床過夜後2500×g離(lí)心0.5分(fēn)鐘(zhōng)（可(kě)以和(hé)一(β<↕$yī)抗一(yī)起孵育）。盡量完全地(dì)移去(qù)上(shà↕>§∑ng)清液并用(yòng)500ul預冷(lěng)的(de)裂解液洗滌3次（每次都(dō₹®≠u)要(yào)離(lí)心棄完上(shàng)清，有(yǒu)利于降低(dī)背景）σγ。

　　(4) 最後一(yī)次洗滌并小(xiǎo)心的(de‌↓™)吸掉上(shàng)清液後，加入50ul 1X Laemmli sa£ ∑mple buffer（或含50mM DTT的™&(de)SDS Sample Loadi ★§ng Buffer）（注意Sample ₽Ω¶Loading Buffer成分(fēn)必¥'須含有(yǒu)還(hái)原劑）。Vortex混勻後加熱(→♥rè)至90-100℃，10分(fēn)鐘(zhōng)。₩‍β>10000×g離(lí)心5分(fēn)鐘(zhō¥€λ∑ng)，小(xiǎo)心收集上(shàng)清。10-30ul上(≠£®&shàng)樣電(diàn)泳，避免上(shàng)樣Beads。

　　注：收集的(de)上(shàng)清液可(kě)以β↔✘←置于-20°C保存。用(yòng)時(shí)解φ¶∞凍後，加入新鮮的(de)DTT并加熱(r♣§è)至90-100℃十分(fēn)鐘(zhōng)。10000×g離(lí)心5分(f→βδēn)鐘(zhōng)，收集上(shàng)清進行 ↕ →(xíng)上(shàng)樣電(diàn)泳。

　　2）. 免疫印迹（Western Blotting）

　　(1) 如(rú)前所述SDS-PAGE電(diàn)♦♣¥₽泳結束。

　　(2) 把蛋白(bái)質從(cóng)SDS聚丙烯>≈↔酰胺凝膠轉移至NC膜上(shàng)。麗(lì)春紅(hóng)-S染色鑒¥λλ定是(shì)否轉膜成功，考馬斯亮(liàng)藍(lán→‌♣)對(duì)SDS-PAGE進行(xíng₹ ₽∞)染色分(fēn)析轉膜效率，蒸餾水(shuǐ)或TBST清洗麗(l±​ì)春紅(hóng)。

　　(3) 在通(tōng)風(fēng)櫃裡(lǐ)，将NC膜在<•True Blot enhancer buffer 浸泡2min，TBSTσ←Ω清洗一(yī)次。

　　(4) 将NC膜浸入5%的(de)脫脂奶粉的(de)封閉"•液中，置于搖床上(shàng)室溫封閉2小(xiǎo)時(shí)。

　　(5) 棄去(qù)封閉液後，加入靶蛋白(bái)一(y✘★"ī)抗（用(yòng)5%脫脂奶粉封閉液稀釋，終濃度需要(yào)預實驗摸索，₹γ​建議(yì)1-2ug/ml）。置于搖床上(shàng)室溫孵育2小(xi♦σǎo)時(shí)或者4℃孵育過夜。

　　(6) 用(yòng)TBST洗滌膜4-5次，每次5-10分(fēn €™)鐘(zhōng)。

　　(7) 棄去(qù)洗液後加入适量的(de)用(yòng ↕γ)5%脫脂奶粉封閉液稀釋好(hǎo)的(δα→de)TrueBlot™（稀釋比為(wèi)1：1000）β•，室溫孵育1小(xiǎo)時(shí)。

　　(8) 用(yòng)PBST或TBST洗滌 ↔<膜4-5次，每次5-10分(fēn)鐘(zhōng)。

　　(9) 用(yòng)合适的(de)過氧化(huà)<∞σλ物(wù)酶HRP化(huà)學發光(guγ✔βāng)底物(wù)并按照(zhào)說(<λαshuō)明(míng)（等量的(de)底物(wù)↓♦A+底物(wù)B）進行(xíng)顯色反應。

　　(10) 在暗(àn)室中用(yòng <‍)X光(guāng)片曝光(guāng)，根據結果調整曝光(guāng)時(±®>↔shí)間(jiān)（10sec、1min、"α•5min和(hé)20min）和(hé)曝光( ₹®♥guāng)區(qū)域,以得(de)到(dào)最佳效果。

　　3）. 注意事(shì)項

　　(1) 免疫共沉澱抗體(tǐ)的(d¶$e)稀釋：用(yòng)于免疫共沉澱的(de)抗體(tǐ)在使用(✔&yòng)之前需要(yào)進行(xíng ‌)稀釋，例如(rú)使用(yòng)濃度為(wèi)1-5ug/107細胞/ml。一(≥¶£yī)般對(duì)于從(cóng)107細胞裂解出σ"♠的(de)大(dà)部分(fēn)蛋白(bái'≥©₩)抗原來(lái)說(shuō)，加入2ug抗體(tǐ)就(jiù≤"✔)足夠了(le)。因為(wèi)盡量減少(shǎo)抗體(tǐ)用(yòng)<÷量可(kě)以降低(dī)還(hái)原性沉澱抗體(tǐ)對(σ¶↓'duì)SDS-PAGE電(diàn)泳樣品檢₽₹→₹測的(de)幹擾。（TrueBlot™并不★¥(bù)能(néng)增強免疫印迹中抗體(tǐ)和(hé)抗原之間(jiān)的(de)特異性'§ 結合，所以如(rú)果用(yòng)于WB的(de)•≠∏±抗體(tǐ)能(néng)與非目的(de)蛋白(bái)産生(shēng)交叉反應₽§，結果也(yě)會(huì)被TrueBlot™檢測出來(lái)）

　　(2) WB的(de)封閉：Mouse, Rabbit 和(hé)♥ π↔Goat IgG TrueBlot™檢測過程中的(de)膜封閉，♥¶↔§一(yī)抗稀釋孵育和(hé)TrueBlot™稀釋孵育過程都(dō₹←u)建議(yì)使用(yòng)5%（w/v）的(de)脫脂奶粉液。BSA不♠©♠✘(bù)建議(yì)使用(yòng)于此過程。

　　(3) 陽性對(duì)照(zhào)：Mo↓↕use, Rabbit 和(hé)Goat ₩→♦IgG TrueBlot™檢測SDS-denature✔£d, non-reduced mouse ∞​§ IgG，所以可(kě)用(yòng)20ng n∑εon-reduced沉澱抗體(tǐ)直接上(shàng)樣電(diàn)泳，然後 φ™WB作(zuò)為(wèi)IgG TrueBlot™的(de)陽性>∞→對(duì)照(zhào)。

　　(4) 陰性對(duì)照(zhào)：WB過程中不(bù)加一(yī)抗，直接加二§♦抗TrueBlot™ beads。

　　(5) SDS-PAGE電(diàn)泳及WB：≥↕✘Mouse, Rabbit 和(hé)Goat IgG Tru&∞eBlot™檢測過程為(wèi)用(yòng)含适量抗氧化(huà)劑上(shàng)樣液電(↔♣diàn)泳，然後Poncean S預染和(hé)20%的(de)乙酸/30%甲醇脫 ∏$♣色；再室溫自(zì)然晾幹1小(xiǎo)時(shσ‍§≤í)，用(yòng)含甲醇的(de)Buffer A ☆ 潤膜後封閉。這(zhè)個(gè)操作(zuò)過程可(kě)以得(de‍π♥)到(dào)很(hěn)好(hǎo)的(de)WB結果，PVDF膜或硝酸✘✔€纖維膜都(dōu)适用(yòng)于此檢測過程。

　　4）.相(xiàng)關緩沖液配方：

　　2X SDS Reducing Sample Loa$πding Buffer (包含50 mM D✘  φTT)

　　950 mL 2X SDS sample buffer

　　50 mL 1M DTT

　　注: 1小(xiǎo)時(shí)內(nèi)使用(yòng₹¶)，過期丢棄。.

　　2X SDS Sample Buffer

　　6% SDS

　　25mM Tris base pHed ₹δ₩to 6.5 with HCl

　　10% glycerol

　　Bromphenol blue

　　注: -20°C長(cháng)時(shí)間(jiān)儲存 ，室溫最多(d±↑φ↔uō)隻能(néng)儲存一(yī)月(yuè)。

　　TBS-Tween (TBS-T):

　　25 mM Tris-HCl, pH 8.0

　　125 mM NaCl

　　0.1% Tween 20

　　Blocking Buffer:

　　5g 脫脂奶粉

　　100ml TBS-T

　　調整PH值為(wèi)7.4

　　Antibody Binding Buffer:

　　 含1% 脫脂奶粉 TBS-T

　　Protease Inhibitor Cocktail (100∑‍X):

　　PMSF, 5mg (50μg/ml)

　　Aprotinin, 100μg (1μg/m≠®☆l)

　　Leupeptin, 100μg (1μg/ml)

　　Pepstatin, 100μg (1μg/ml)

　　Phosphatase Inhibitor (100X):

　　1mM Na3VO4

　　1mM NaF

　　注： IP: Immunoprecitaton免疫共沉澱. WB₩∑♣: Western Blot蛋白(bái)質印記

參考文(wén)獻：

1. Alegria-Schaffer A, Lod×∞'ge A, Vattem K. 2009. Performing an£↕∑d optimizing Western blots with an emphasis on•✔∏♦ chemiluminescent detection¥∑. Methods Enzymol. 2009;463:573-99.

2. Haan C, Behrmann I. 2007.$  A cost effective non-commercial ECL-sol ÷‌ution for Western blot detections yield≤α'ing strong signals and low background↓₽. J Immunol Methods. Jan 10;318(1-2):11-9.

3. Immunoblot affinity purification. 2005.®♦≤ Nature Methods 2, 797Ω★≥¶ – 798.

4. Uhlig U, Uhlig S, Branscheid D, Za​☆bel P, Vollmer E, Goldmann €₽T. 2004. HOPE technique enables Western blot a★₹nalysis from paraffin-embedded tissues. Pathol $≠λRes Pract. 2004;200(6):469-72.

5. Wu M, Stockley PG, Martin WJ 2nd. 2002α₹σ. An improved western‌λ blotting technique effeε¥☆§ctively reduces backgroun‍ק¥d. Electrophoresis. Aug&©;23(15):2373-6.