一(yī)、說(shuō)明(míng)

HIV整合酶可(kě)以将HIV DNA整合入宿主細胞DNA↔₽，因此，整合酶成為(wèi)艾滋病研究的→"(de)潛在靶标。

按照(zhào)實驗方案，向預包被鏈黴親和(hé)素的(de)96孔闆依次加入：

　a)DS DNA（double-stranded HIV-1 LTR U5 donorσ✘♦ substrate DNA，末端生(shēng)物(wùλ ¶)素标記）

　b)全長(cháng)的(de)重組HIV-1整合酶

　c)抑制(zhì)劑或實驗樣品

　d)TS DNA（double-stranded target su<" αbstrate，3’-末端修飾）

　e)TMB 底物(wù)

　f)終止液

催化(huà)反應：HIV-1整合酶催化(huà)從(cóng)DS DNA向TS₹® DNA的(de)核酸鏈轉移重組反應

檢測反應産物(wù)：加入HRP-标記的(de)抗體(tǐ) + TMB底☆αε物(wù)

二、試劑盒組分(fēn)

★ 在上(shàng)述儲存條件(jiàn)下(xià)，試劑盒可(kě)以穩定保持1年(®→β‌nián)。

★ 打開(kāi)箔片包裝袋後，本次實驗未使用(yòng)的(de)微(wēi)孔闆條須密®αα•封好(hǎo)，放(fàng)回箔片包裝袋中，儲♦<±存于2~8℃。

★ 實驗之前，反應緩沖液（2 ml /孔）應該添加14Ω♠β≈.5 M β-巯基乙醇（BME 0.4 μl/1 ml）激活。BME激活的(de)反應緩沖液λ€‌÷可(kě)以在2~8℃穩定保持1周。儲存期間(jiān)，反應緩沖液可£↔(kě)能(néng)出現(xiàn)沉澱×÷₩≤，所以使用(yòng)之前，反應緩沖液可(kě)以 37℃水(s←₩huǐ)浴。

三、實驗前注意事(shì)項

一(yī)般建議(yì)：

開(kāi)始試驗之前，請(qǐng)仔✘​₽細閱讀(dú)操作(zuò)方案，因為(wèi)細微(wēi♦φ)的(de)差錯(cuò)就(jiù)會(huì)影(yǐngφ←)響最終結果。為(wèi)了(le)得(de)到(dào)優良的(de)結果，請(qǐng×↓•)優先使用(yòng)闆內(nèi)部的(de)、近(jìn)中心的(de)孔≠≤'∏。z

配置洗液：

提供的(de)是(shì)20×，使用(yòng)之前，混勻50 ml 濃縮洗液 +↑¥ 950 ml滅菌蒸餾水(shuǐ)，稀釋至1×。

反應緩沖液：

該緩沖液含有(yǒu)錳、鎂。使用(yòng)之前，添加0.4 μl/1 ml 2-ME激活。每εΩ孔需要(yào)使用(yòng)反應緩沖液 2 ml。隻激活本次®↕實驗使用(yòng)的(de)這(zhè)一(yī)份反應緩 ≥$↑沖液，而不(bù)要(yào)把整瓶220 ml 反應緩沖液一(yī)次全部激活。取用(★δ♣ yòng)之前，輕輕把瓶子(zǐ)搖勻。♥≤

DS and TS DNAs：

提供的(de)是(shì)100×。使用(yòng)之前÷→，用(yòng)反應緩沖液稀釋100倍至1×。TS DNA易于粘附離(lí)心管壁。

HIV-1 整合酶：

每次使用(yòng)之前置于冰上(shàng)解凍，保證酶的(de)‌✔穩定。

洗闆：

可(kě)以人(rén)工(gōng)洗，也(yě)可(kě)以用(yòng)×"自(zì)動洗闆機(jī)洗。每次洗後，輕輕拍(pāi)打，完全除去(qù)孔內(nèi)的(deπ‍∞)殘液。

複孔：

建議(yì)所有(yǒu)樣品和(hé)對(du¥✘ì)照(zhào)都(dōu)做(zuò)2~3個(gè)重複πΩ。

四、操作(zuò)流程

DS 包被 和(hé) SA 闆封閉

1. 複溫：

實驗之前，反應緩沖液、封閉液 37℃水(shuǐ)浴10 min。除了(le)HIV-1 整"∑€合酶（置于冰上(shàng)解凍），其餘試劑都(dōu)複溫至室溫。

2. 包被DS DNA

本次未使用(yòng)的(de)闆條重新±∏ α密封好(hǎo)，放(fàng)回箔片包裝袋。用(yòng)反應緩沖液<↑稀釋本次使用(yòng)的(de)DS DNA至1σ<×（10 μl DS DNA 100× 溶液 + 990 μl 反應緩沖液）。每孔加入100 ml∞± 1× DS DNA，37℃培養箱孵育30 min。反應緩沖液放(♣≈fàng)回37℃水(shuǐ)浴。

3. 封閉

吸去(qù)孔內(nèi)液體(tǐ)，用(yòng)300 μl 1× 洗液洗5次。每♠∑孔加入200 μl 封閉液，37℃培養箱孵育30 min。

如(rú)果需要(yào)，闆可(kě)以置于2~8℃過夜，在稍晚接著(zhe)方案做(zuò÷∞© )實驗之前，37℃培養箱孵育20 min即可(kě)。但(dàn)是(sh÷©•✔ì)如(rú)果在一(yī)天之內(nèi)連續做(zuò)完，實驗結果會(huì)更好(hǎo ®<↔)。

整合酶反應

4.将整合酶加入 DS DNA孔

使用(yòng)之前，HIV-1 整合酶置于冰上(shàng)或2~8✔→℃解凍（大(dà)約5 min），快(kuài)速離(lí)心管子(zγ€εǐ)（例如(rú)10000 RPM × 5♣δ®β sec）。用(yòng)反應緩沖液以1︰300稀釋（2 μl HIV-1 整合酶βε₽← + 598 μl 反應緩沖液）。吸去(qù‍ &)孔內(nèi)液體(tǐ)，用(yòng)200 μl 反應緩沖液洗3次。每孔加♦π≈Ω入100 μl 反應緩沖液（陰性對(duì)照(zhào)）或整合酶溶液（陽性₽δ對(duì)照(zhào)），37℃培養箱孵育30 min。反應緩沖液放(∑βφ₹fàng)回37℃水(shuǐ)浴。

5. 加抑制(zhì)劑和(hé)檢測物☆ ↔(wù)

制(zhì)備實驗樣品：用(yòng)反應緩沖液稀釋至2×最終♠‌≈要(yào)求的(de)實驗樣品濃度。例如(rú)，當實驗要(yào)求的(de)樣π∏₹品最高(gāo)濃度是(shì)10 μM或10 μg/ml時(shí♠¥♥∏)，用(yòng)反應緩沖液制(zhì)備20 μM或20 μg/ml的(de)樣品，以及系列↔↕稀釋。疊氮鈉稀釋至0.30%（2×濃度或0.15%最終1×濃度），抑制(zhì)大(dà)約50%δ¶整合酶活性。

吸去(qù)孔內(nèi)液體(tǐ)，用(yòng)200 μl 反應緩₹€沖液洗3次。每孔加入50 μl對(duì)照(zhào)，或用(yòng)反應緩沖液制(zhσ>ì)備的(de)50 μl 實驗樣品（negative ×∑∑control）或整合酶溶液（positive ♦♠&control），室溫孵育5 min。

6. 加入 TS DNA

用(yòng)反應緩沖液稀釋本次使用(yòng)的(de)TS DNA至1×（10 μl TS<γ±≈ DNA 100× 溶液 + 990 μl 反應緩沖液）。每孔直接加入50 ♥≥‌ml 1× TS DNA。輕輕敲打以混勻。37℃孵育30 min。

檢測反應

7. 加 HRP-抗體(tǐ)

吸去(qù)孔內(nèi)液體(tǐ)，用(yòng)300 μl 洗液洗5次。每孔加入100>≠α μl HRP 抗體(tǐ)，37℃孵育3δ↓δ≤0 min。

8. 加入TMB 底物(wù)

吸去(qù)孔內(nèi)液體(tǐ)，用(y↕<®òng)300 μl 洗液洗5次。每孔加入100 μ§↕l TMB 過氧化(huà)物(wù)酶底物(wù★₩α) 溶液，室溫孵育10 min。

9. 加入 TMB 終止液

孔中直接加入100 μl TMB 終止液。用(yòng)槍頭弄破任何較大(dà)的(✔εde)氣泡。用(yòng)讀(dú)闆機(jī)以最小(xπ♠iǎo)0.1 sec讀(dú)取450 nm處吸光(guāng)度≠£。加入TMB 終止液後，應該在10 min內(n‍ èi)讀(dú)闆。

如(rú)果OD450吸光(guāng)度超過了•‍≈(le)讀(dú)闆機(jī)的(de)範圍，為(↕® wèi)了(le)實現(xiàn)更準确的(de)讀(dú)∑$£數(shù)和(hé)數(shù)值終點，可(kě)以将反應物(✘×↑ wù)稀釋。将100 μl 反應液 + 1≥δ∑λ00 μl 去(qù)離(lí)子(zǐ)水(shuǐ)加入稀釋闆（無 SA-co♥÷★₽ated），讀(dú)取450 nm處吸光(guāng)度。此稀釋樣 ™品的(de)吸光(guāng)值應該乘以2。