方案A: 刺激活化(huà)小(xiǎo)鼠外(wài)周T細胞方案。 

方案B：刺激活化(huà)人(rén)PBMC方案。

方案A: 刺激活化(huà)小(xiǎo)鼠外(wài)周T細胞←↑♣↓方案

1、材料

1×PBS無菌

Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (✘ ​Functional Grade, Cat. No.↔Ω 16-0031, or Purified, Cat.↑ §≈ No. 14-0031) Anti-mous§↑₽↑e CD28, Clone 37.51 ($≈Functional Grade, Cat. No. 16-0281)α®★

RPMI1640完全培養基：

　　900 mL RPMI-1640 (HycloneΩ ↓± Cat. No. SH30027.02)

　　100 mL FBS (Hyclone Cat. No.♦♣ SH30151.03) Heat inactivated (10% fi✔§nal)

　　1 mL 2-mercaptoethanol (Gibco BRL Cat. ≥ No. 21985-023)

　　10 mL L-Glutamine (Hyclone ≤₩₽∑Cat. No. SH30034.01)

　　Antibiotic cocktail (可(kě)選)

小(xiǎo)鼠脾髒或淋巴結單細胞懸液（無菌）

帶蓋的(de)無菌96孔培養闆（Costar Cat. No. 3596）

刀(dāo)豆蛋白(bái)A（ConA, Sigma Cat. No.β↓λ¥ C5275）

2、儀器(qì)

吸管和(hé)移液器(qì)

37度CO2培養箱

台式低(dī)溫離(lí)心機(jī)

3、實驗持續時(shí)間(jiān) 

包被抗體(tǐ)時(shí)間(jiān)：2-18小(xiǎo÷§±¥)時(shí)

制(zhì)備脾髒單細胞懸液時(shí)間(jiān)：20分(fēn)鐘(zhōng∏↔<)

處理(lǐ)細胞培養時(shí)間(jiānσ ✔)：20分(fēn)鐘(zhōng)

培養時(shí)間(jiān)：2-4天

4、實驗方案 

1）抗體(tǐ)預包被：

(1) 用(yòng)無菌PBS配制(zhì)5-10ug/m€ £l 的(de)CD3e抗體(tǐ)溶液，根據實驗設計(jì)和(hé)複孔的(de)數(s​φ→βhù)目計(jì)算(suàn)所需抗體(tǐ)工(gōng)作(zuò)液的(deφ♠)量。例如(rú)包被48孔，則需要(yào)抗體(t₹₩ǐ)體(tǐ)積為(wèi)2.6ml。

(2) 每孔加CD3e抗體(tǐ)溶液50ul，空(kōng)白(bái)孔加PBS。

(3) 蓋闆，四度孵育過夜或37度孵育2小(xiǎo)時(shí)。

(4) 除去(qù)抗體(tǐ)溶液，無菌PBS洗滌2αα&®次，即可(kě)加細胞懸液。

2）添加細胞：

(1) 取小(xiǎo)鼠脾髒制(zhì)備單細胞懸液 >，按照(zhào)方案除去(qù)紅(hóng)細胞。 σ ♦≠(2) 完全培養基定容細胞為(wèi)106/ml（該密度是(shì)TCR介導T細胞活化(huàγ"$)實驗的(de)最佳濃度；亦可(kě)依據自(zì)≈✘♦γ己實驗經驗摸索最佳濃度）。

(3) 每孔加200ul細胞懸液（可(kě)加1-4₹±₹ug/ml，ConA刺激）。

(4) 加入可(kě)溶性的(de)CD28抗體(tǐ)，2ug/mlφ↔↓。

(5) 37°C, 5% CO2培養箱培養2-4天，具體(t≤‍∞ǐ)增殖的(de)最佳時(shí)間(jiān☆₩☆)依賴實驗者摸索。

(6) 收獲細胞，繼續其他(tā)方面的(de)實驗。

方案B：刺激活化(huà)人(rén)PBMC方案

1、材料

1×PBS無菌

Anti-human CD3e, Clone OKT3Function≈ →'al Grade, Cat. No. 16-0037, o✘↓Ω×r Clone HIT3a, Cat. No. 16€↓€α-0039)

Anti-human CD28, Clone 28.2 (Functional G↕≠♠εrade, Cat. No. 16-0289)

RPMI1640完全培養基：

　　900 mL RPMI-1640 (Hyclone Cat. No. ₹γSH30027.02) 

　　100 mL FBS (Hyclone Cat&β. No. SH30151.03) Heat inacti<♣>vated (10% final) 

　　1 mL 2-mercaptoethanol (Gibco BRL Caα↓ t. No. 21985-023) 

　　10 mL L-Glutamine (↑♣Hyclone Cat. No. SH30034.01) 

　　Antibiotic cocktail (可(kě)選)

無菌PBMC細胞懸液

帶蓋的(de)無菌96孔培養闆（Costar Cat. No. 3596）

2、儀器(qì)

吸管和(hé)移液器(qì)

37度CO2培養箱

台式低(dī)溫離(lí)心機(jī)

3、持續時(shí)間(jiān)

包被抗體(tǐ)時(shí)間(jiān)：2-18小(xiǎo)時(shí)

制(zhì)備脾髒單細胞懸液時(shí)間(jiān)：30分(fēn)鐘(zhō☆↑‍ng)

處理(lǐ)細胞培養時(shí)間(jiān)：20分(fēn)鐘(zhōng)€★↔

培養時(shí)間(jiān)：2-4天

4、實驗步驟

1）抗體(tǐ)預包被：

(1) 用(yòng)無菌PBS配制(zh ™€←ì)5-10ug/ml 的(de)CD3e抗體(tǐ)溶液，根據實驗設γλ計(jì)和(hé)複孔的(de)數(shù)目計(jì)算(suàn)所需抗體(↑ ​εtǐ)工(gōng)作(zuò)液的(de)量。例如(rú)包被48孔，則需要(yào)抗體(tǐ↕$σ™)體(tǐ)積為(wèi)2.6ml。

(2) 每孔加CD3e抗體(tǐ)溶液50​≤×ul，空(kōng)白(bái)孔加PBS。

(3) 蓋闆，四度孵育過夜或37度孵育2小(xiǎo)時(shí)。

(4) 除去(qù)抗體(tǐ)溶液，無菌PBS洗滌2次σ€δ→，即可(kě)加細胞懸液。

2）添加細胞：

(1) 提取人(rén)類PBMC單細胞懸液。

(2) 完全培養基定容細胞為(wèi)106/ml（該密度是(shì)TCR介導↕εT細胞活化(huà)實驗的(de)最佳濃度；亦可∏€≈£(kě)依據自(zì)己實驗經驗摸索最佳濃度）。

(3) 每孔加200ul細胞懸液（可(kě)加1-4ug/ml，ConA刺激）。

(4) 加入可(kě)溶性的(de)CD28抗體(tǐ)，2ug/ml。

(5) 37°C, 5% CO2培養箱培養2±☆§-4天，具體(tǐ)增殖的(de)最佳時(shí)''"©間(jiān)依賴實驗者摸索。

(6) 收獲細胞，繼續其他(tā)方面的(de)實驗。