1、材料

L-929 細胞系（ATCC Cat# CCL-1）或A549λ ‍ 人(rén)類肺癌細胞（ATCC Cat# CCL-185）

培養基：RPMI1640+10%FBS。

檢測培養基：RPMI1640+2%FBS。

96孔闆（平底）（Costar Cat.No.3595）

EMC病毒（腦(nǎo)心肌炎病毒），107pfu/ml 等分(fēn)-80度凍↕σα存（避光(guāng)）。

MTT溶液：（Sigma Cat. No. M5655）5mg/ml 儲液（PB₹αS稀釋），室溫避光(guāng)保存。

MTT裂解液：20%SDS或50%DMF。

2、儀器(qì)

吸管和(hé)移液器(qì)

恒濕培養箱

96孔微(wēi)孔檢測分(fēn)光(guāng)光(guāng)‌ •σ度計(jì)

3、持續時(shí)間(jiān)

孵育時(shí)間(jiān)24小(xiǎo)時(shí)

測定樣品準備時(shí)間(jiān)1小(xiǎo)時(shí)

4、實驗步驟

(1) 使用(yòng)檢測培養基制(z♣₩hì)備L929或A459懸液，調整細胞濃度為(wèiασ)3.5×105/ml，每孔加100ul細胞懸液。37度 5%CO2 恒濕培養箱培養過Ω→≠夜。

(2) 另一(yī)塊稀釋闆中每孔加50ul檢測培養基。

(3) 使用(yòng)兩倍的(de)連續稀釋液從(cóng)第3排到(dào)第12排依次稀™✘釋功能(néng)級别的(de)抗細胞因子( ‌zǐ)抗體(tǐ)（見(jiàn)速查表标準範圍），留1,2排不(bù)加。

(4) 2排到(dào)12排每孔加50ul重組細胞因子(zǐ)和(hé×®>♦)樣品（濃度見(jiàn)速查表，第二排是(shì)細胞因子(z§☆ǐ)和(hé)指示細胞組），1排是(shì)隻有(yǒu)細胞的(de)對(du"♥÷ì)照(zhào)組。

(5) 37度 5%CO2 恒濕培養箱培養2小(xiǎo)時(shí)。

(6) 将50ul的(de)抗原抗體(tǐ)混合液加到(♠→®dào)包含細胞的(de)對(duì)應孔中。

(7) 孵育6小(xiǎo)時(shí)。

(8) 小(xiǎo)心棄上(shàng)清，加100ul EMC病毒液調整密度βφ∑→為(wèi)1-4×104pfu/ml（人(rén)類IFN-γ 1:< Ω∑20稀釋病毒儲液；而小(xiǎo)鼠IFN-γ 1:1000稀釋病毒儲液）

(9) 37度 5%CO2 恒濕培養箱培養40小(xiǎo)時(shí)。λ™↑÷

(10)每孔加10ul MTT溶液（5mg/ml），孵育4小(xiǎo)©✔<時(shí)。

(11)每孔加50ul MTT 裂解液，孵育過夜。♥γ

(12)570-650nm 讀(dú)闆。

(13)繪制(zhì)标準曲線分(fēn)析數Ω£₽(shù)據。