檢查流式細胞儀陽性單一(yī)顔色對(duìπ‌)照(zhào)是(shì)否正确，通(tōng)道(dào)和(hé§‍☆★)補償設置是(shì)否能(néng)正确的(de)捕獲所有(yǒ→•→u)粒子(zǐ)。

沒有(yǒu)足夠的(de)抗體(tǐ)來(lái)檢測

增加抗體(tǐ)的(de)量/濃度

無法接近(jìn)細胞內(nèi)目标

檢查目标蛋白(bái)是(shì)否在細胞內↕σε(nèi)。對(duì)于胞內(nèi)染色 ∏↔，确保有(yǒu)足夠的(de)通(tōng)透性。為(wèi)防止細≈₹∑胞表面蛋白(bái)質的(de)內(nèi)化(huà)，該過程應用(yòng)冰冷(✘$÷♥lěng)的(de)試劑，在冰上(shàng)或4←γ℃進行(xíng)，以終止一(yī)切反αα應。加入疊氮化(huà)鈉可(kě)防止表面抗原÷♥的(de)修飾和(hé)內(nèi)化(huà)帶來(lái)的(de)熒光 ₽ (guāng)強度的(de)損失。對(du♠βì)于細胞系染色，胰蛋白(bái)酶可(kě)以引起細胞表面蛋白(bái₽≈☆)質的(de)內(nèi)化(huà)，尤其₽ε是(shì)細胞表面分(fēn)子(zǐ)，可(Ω®✘kě)能(néng)需要(yào)更溫和(hé)的(de)©δ分(fēn)離(lí)方法。

細胞內(nèi)染色結合熒光(guāng)分(fēn)子(zǐ)太大(dà)

對(duì)細胞內(nèi)染色實驗，熒光(guāng)分(fēn)子₹>±(zǐ)應具有(yǒu)較小(xiǎo)的(de)分(fēn)子(zǐ)量。大(dà)分(f££↑φēn)子(zǐ)量熒光(guāng)染料會(h →↑uì)降低(dī)抗體(tǐ)的(de)動力和(h''é)進入細胞的(de)可(kě)能(néng)性。

激光(guāng)器(qì)未對(duì)齊

确保流式細胞儀的(de)激光(guāng)器(qì)正确對(d✘™uì)齊，必要(yào)時(shí)通(tōng)過運行(xíng)液✘¥™流檢查微(wēi)球來(lái)調整路(lù)線。如(r" ú)果激光(guāng)器(qì)不(bù)能£'(néng)正确對(duì)準或發生(sh↕>ēng)漂移時(shí)，您可(kě)能(né÷€ng)需要(yào)考慮聯系此機(jī)的(de)客服。

目标蛋白(bái)不(bù)存在或處于低(dī)水(sh✔Ω↕σuǐ)平表達

确保組織或細胞類型表達的(de)目标蛋白(bái)處​§于一(yī)個(gè)足夠檢測的(de)量。

可(kě)溶性或分(fēn)泌型目标蛋白(bái)

目标蛋白(bái)是(shì)否可(kě)溶并從(cóng)細胞內&≤∞(nèi)分(fēn)泌？需要(yào)嵌合在細胞膜上(shàng)或存在于細胞質裡(l<≤₩ǐ)以便流式細胞儀能(néng)很(hěn)容易檢測到(dào)。通(tōng)過高(g>♠āo)爾基體(tǐ)封閉的(de)步驟，比如(rú)加入Brefeldin A，可(kě)提高(g​σāo)細胞內(nèi)染色信号。

補償過高(gāo)或增益過低(dī)

使用(yòng)陽性對(duì)照(zhào)再次設置流式細胞儀，利用(yòn ÷g)補償以确保細胞的(de)熒光(guāng)信号不(÷φ&bù)被切斷，提高(gāo)增益以增強信号 ε↓α（在合理(lǐ)的(de)範圍內(nèi)）。

熒光(guāng)分(fēn)子(zǐ)的δ↑Ω(de)熒光(guāng)逐漸消退

抗體(tǐ)可(kě)能(néng)放(fàng)置時(shí)間(jiān)太長(>↕cháng)或沒有(yǒu)避光(guāng)。

一(yī)抗和(hé)二抗不(bù)匹配

二抗應該是(shì)和(hé)一(yī)抗來(lái)π±α≠源物(wù)種相(xiàng)同（例如(rú)一(yī)抗來(lái)源于兔，就(j​≥iù)要(yào)使用(yòng)抗兔的(de)二抗）¥↑&≠。

熒光(guāng)強度過高(gāo)

抗體(tǐ)濃度過高(gāo)

這(zhè)将導緻較高(gāo)的(de)非特異性結合或非常高δ (gāo)的(de)熒光(guāng)強度，減少(shǎo)每個(gè)樣本中加λ♠入的(de)抗體(tǐ)量。

過量抗體(tǐ)被困

這(zhè)是(shì)細胞內(nèi)染色特有(yǒu)的(de)問(wèn)題，較大(dà)∏♠∏的(de)熒光(guāng)分(fēn)子(zǐ)使抗體(tǐ)被困在細胞 ≥中。确保洗滌步驟充分(fēn)，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或Trito★≤n。

封閉不(bù)足

與封閉步驟一(yī)樣，抗體(tǐ)中加入1-3%封閉試劑。‍ φ​

背景高(gāo)或陽性細胞百分(fēn)比高(gāo)

增益設置過高(gāo)或補償過低(dī)

使用(yòng)陽性對(duì)照(zhào)再次設置流↑≈式細胞儀，用(yòng)補償減少(shǎo)顆粒背景并減少(shǎo)增益以降低(d£★ī)信号。

抗體(tǐ)過量

降低(dī)抗體(tǐ)濃度。您還(hái)可(kě)以在洗滌緩沖液中添加去(q®↕ù)污劑，以确保洗去(qù)多(duō)"♥ ★餘的(de)抗體(tǐ)。