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技(jì)術(shù)服務中心
流式輔助試劑、工(gōng)具
流式細胞技(jì)術(shù)分(fēn)析的(de)過程中，有(yǒu)很(hěn)← 多(duō)因素會(huì)影(yǐng)響實驗結果：樣本的(de)處理(lǐ)、熒光(guān≥♥®•g)補償的(de)調節、Fc受體(tǐ)的££↔↑(de)阻斷、活細胞和(hé)死細胞的(de)鑒别等。
eBioscience公司提供流式染色緩γ✔♥沖液、細胞固定液、細胞破膜劑、細胞刺激劑、細胞阻斷劑↑≥、FcR抗體(tǐ)、紅(hóng)細胞裂解液、細胞活性染料、←ε™φ細胞計(jì)數(shù)微(wēi)球、熒光(guāng)補償微(wēi)球等。×$為(wèi)您的(de)流式實驗提供更穩定的(de)結果。
流式Buffer
Intracellular Stainin∑£₹g Buffer Selection | ||
Antigen | Foxp3 Staining Buffer Set | Fixation & Permeabilization |
HUMAN |
|
|
IFNy | * | YES |
IL-1a | nt | YES |
IL-1b | nt | YES |
IL-2 | nt | YES |
IL-4 | * | YES |
IL-5 | nt | YES |
IL-6 | nt | YES |
IL-9 | nt | YES |
IL-10 | * | YES |
IL-12 | nt | YES |
IL-13 | nt | YES |
IL-17A | YES | YES |
IL-17F | nt | YES |
IL-21 | * | YES |
IL-22 | * | YES |
Granzyme B | nt | YES |
Perforin | nt | YES |
TNFalpha | YES | YES |
Eomes | YES | NO |
Foxp3 | YES | NO |
Gata-3 | YES | NO |
RORy(t) | YES | NO |
T-Bet | YES | NO |
|
|
|
MOUSE |
|
|
IFNy | YES | YES |
IL-1b | nt | YES |
IL-2 | YES | YES |
IL-4 | * | YES |
IL-6 | nt | YES |
IL-10 | * | YES |
IL-17A | YES | YES |
IL-17F | YES | YES |
IL-21 | NO | YES |
IL-22 | * | YES |
Granzyme B | YES | YES |
Perforin | YES | YES |
TNFalpha | YES | YES |
Eomes | YES | NO |
Foxp3 | YES | NO |
Gata-3 | YES | NO |
Nanog | YES | NO |
Oct 3/4 | YES | NO |
RORy(t) | YES | NO |
T-Bet | YES | NO |
nt = Not tested YES = Staining compatible with this ∞≈≤₩buffer system NO = Staining not compatible with this€€↓£ buffer system *Staining is possible with the Foxp3 Staining B★☆§uffer Set, although in some cases a reduct ✘ion in brightness has been observed↔φ♥∏. No change in "♥₩the percentage of positive cells has be✔✘←en observed. | ||
| ||
磷酸蛋白(bái)特異性流式抗體(tǐ)Buffer≥ 選擇指南(nán)
Target | Clone | IC fix/perm | Foxp3 | IC fix/methanol |
pSTAT1 (Y701) | KIKSI0803 | - | - | +++ |
pSTAT4 (Y693) | 4LURPIE | - | - | +++ |
pSTAT5 (Y694) | SRBCZX | - | - | +++ |
pSTAT6 (Y641) | CHI2S4N | - | - | +++ |
pSrc (Y418) | SC1T2M3 | ++ | ++ | +++ |
pZAP-70/SYK Y319/Y352 | n3kobu5 | ++ | ++ | +++ |
pSYK (Y348) | moch1ct | ++ | ++ | +++ |
pBTK/ITK (Y551/Y511) | M4G3LN | ++ | ++ | +++ |
pERK1/2 (T202/Y20÷±£4) | MILAN8R | - | - | +++ |
pNFkB p65 (S529) | B33B4WP | +++ | - | +++ |
pS6 (Y235/Y236$) | cupk43k | +++ | ++ | +++ |
pH2AX (S139) | CR55T33 | - | +++ | +++ |
細胞刺激/阻斷劑
細胞刺激：未活化(huà)的(de)細胞所分(fē★∞↔n)泌的(de)細胞因子(zǐ)很(hěn)少(shǎoβ←)，用(yòng)流式細胞術(shù)很(hěn)難檢測出來(lái)，因此在檢測§←≥≠前需要(yào)刺激淋巴細胞使其活化(huàε ↕)。eBioscience提供多(duō)種細胞刺ππ激物(wù)：ConA、LPS、PMA、PHA-L
細胞因子(zǐ)轉運抑制(zhì)劑： 細胞在活化(∏★®huà)後，分(fēn)泌的(de)細胞因子(zǐ)會(huì)轉運到(dào)細胞外(w≤₩ài)。流式檢測隻能(néng)對(duì)細胞表面或細胞內(nèi)部的(de)抗∑λ原進行(xíng)檢測，因此必須阻止細胞因子(zǐ)分(fēn)α∏↓$泌到(dào)細胞外(wài)，使其聚集在細胞內(nèi)。常↑∞$用(yòng)的(de)阻斷劑有(yǒu)BFA和(hé)Monensin。
Mouse Cytokines: Intracellular Staining∑¶ Quick Guide | ||||||
Mouse Cytokine | Cell Source | Activation | Incubation Time | Restimulation | Intracellular Block | Antibody |
GM-CSF | mouse spleen | ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20n λ€g/mL) (3d) | 2d/3d | anti-CD3 (10ug/mL immobilized)♦∏± + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr | Brefeldin A | MP1-22E9 |
IFN-gamma | mouse spleen | ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng÷•♣/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d) | 2d/3d | anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-C÷"D28 (2ug/mL soluble) 5hr | Brefeldin A | XMG1.2 |
IL-1 alpha | mouse PEC | mIFNγ (100ng/mL) (2hr)/LPS (100n•₽εg/mL)(22hr) | 2hr/22hr | - | Brefeldin A | ALF-161 |
IL-1 beta | mouse PEC | LPS (100 ng/mL) (22hr) | 22hr | - | Monensin | NJTEN3 |
IL-2 | mouse spleen | ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (2ασ0ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d) | 2d/3d | anti-CD3 (10ug/mL immobi>∏lized) + anti-CD28 (2ug/mL solu&σ"ble) 5hr | Brefeldin A | JES6-5H4 |
IL-4 | mouse spleen | Th2 polarized | 6d | PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr | Brefeldin A | BVD6-24G2, |
IL-5 | mouse splenic CD4 | ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20n§↓∞g/mL) (3d) | 2d/3d | immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble)≤×↑♠ 5hr | Brefeldin A | TRFK5 |
IL-6 | mouse PEC | LPS (100 ng/mL) (22hr) | 22hr | - | Monensin | MP5-20F3 |
IL-10 | mouse spleen | ConA (3ug/mL) (2d)/IL-∞σ≤2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) ( ©3d) | 2d/3d | anti-CD3 (10ug/mL immobiliz÷ed) + anti-CD28 (2ug/mL >¥βsoluble) 5hr | Brefeldin A | JES5-16E3, |
IL-12/IL-23 (p40) | mouse PEC | LPS (100 ng/mL) (22hr) | 22hr | - | Brefeldin A | C17.8 |
IL-13 | mouse spleen | Th2 polarized | 6d | PMA (50 ng/mL) + Ionomy✘ cin (1 ug/mL) 5hr | Brefeldin A | eBio13A |
IL-17A | mouse spleen | Th17 polarized | 6d | PMA (50 ng/mL) + Ionomy♣πcin (1 ug/mL) 5hr | Monensin | eBio17B7 |
IL-17F | mouse spleen | Th17 polarized | 6d | PMA (50 ng/mL) + Ionomyci£↓×n (1 ug/mL) 5hr | Monensin | eBio18F10 |
IL-21 | mouse spleen | Th17 polarized | 9d | PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/®∑♠∞mL) 5hr | Monensin | FFA21 |
IL-22 | mouse spleen | Th17 polarized | 12d | PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr™∞ | Brefeldin A | IL22JOP |
IL-23 p19 | mouse bone marrow | mGM-CSF (40 ng/mL) | 8d | LPS (1 ug/mL) (24 hr) | Monensin | fc23cpg |
MCP-1/ CCL2 | mouse PEC | LPS (100 ng/mL) (24hr) | 24hr | - | Brefeldin A | 2H5 |
TNF alpha | mouse spleen | ConA (3ug/mL) (2d)/IL£σ§-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d) | 2d/3d | anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + antε☆₩εi-CD28 (2ug/mL soluble) λ 5hr | Brefeldin A | MP6-XT22, |
Annotations: mouse PEC=mouse t§¶hioglycolate-elicited peritonea←¶l macrophages; ConA=Concanavalin A; I©πono=Ionomycin; LPS=Lipopo↑ε×≈lysaccharide; PMA=Phorbol Myris✔₩→>tate Acetate; 2d=2 day ∑✔σ culture; 5hr=5 hour cul♥∑↕ture | ||||||
Human Cytokines: Intracellular←• Staining Quick Guide | ||||||
Human Cytokine | Cell Source | Activation | Incubation Time | Restimulation | Intracellular Block | Antibody |
G-CSF | PBMC | LPS (1 ug/mL) | 24hr | - | Monensin | 8F5CSF |
GM-CSF | PBMC | PMA (30-50ng/mL)/Iono (1∞γ¥₹ug/mL) | 5hr | - | Monensin | BVD2-21C11 |
IFN gamma | PBMC | PMA (30-50ng/mL)/Iono λπ®(1ug/mL) | 5hr | - | Brefeldin A | 4S.B3 |
IL-1 alpha | PBMC | LPS (1 ug/mL) | 24hr | - | Monensin | 364/3B3-14, CRM8 |
IL-1 beta | PBMC | LPS (100ng/mL) | 4hr | - | Brefeldin A | CRM56 |
IL-1RA | PBMC | LPS (100ng/mL) | 24hr | - | Brefeldin A | CRM17 |
IL-2 | PBMC | PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL) | 4-6hr | - | Brefeldin A | MQ1-17H12 |
IL-4 | PBMC | PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL) | 4-6hr | - | Brefeldin A | 8D4-8 |
IL-5 | CD4 | Th2 polarizing cultures | 6d | PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (5hr♣€) | Brefeldin A | TRFK5, JES1-5A10 |
IL-6 | PBMC | LPS (100ng/mL) | 24hr | - | Brefeldin A | MQ2-13A5 |
IL-9 | CD4 | Th2 polarizing cultures | 6d | PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (↓∏5hr) | Monensin | MH9A4 |
IL-10 | CD4 | Th2 polarizing cultures | 6d | PMA (50ng/ml) + Ionomycin • λ↕(1ug/ml) (5hr) | Monensin | JES3-9D7 |
IL-12/ IL-23 (p40) | PBMC | hIFN gamma (100ng/mL) δ ®"(2hr)/LPS (100ng/mL) (22®β↔hr) | 2hr/22hr | - | Brefeldin A | C8.6 |
IL-13 | CD4 | anti-CD3 (10ug/mL, immobilized) + ant↓¥i-CD28 (2ug/mL, soluble) + IL-2 (£≤✘10ng/mL) + IL-4 (20ng/mL) (2d); IL-2 ♦✔☆←(10ng/mL) + IL-4 (20ng/mL) (3d) | 2d/3d | PMA (5ng/ml) + Ionomycin (500ng/ml) (4hr) | Brefeldin A | PVM13-1 |
IL-17A | PBMC | Th17 polarizing cultures | 6d | PMA (50ng/ml) + Ionomycin (1ug/m∞✔≠ l) (5hr) | Brefeldin A | eBio64CAP17, eBio64DEC17 |
IL-21 | PBMC | PMA (30-50ng/mL)/Iono (1 Ω∏ug/mL) | 4-7hr or 12-18hr | - | Brefeldin A | eBio3A3-N2 |
IL-22 | CD4 | Th17 polarizing cultures | 6d | PMA (50ng/ml) + Ionomycin×¥ (1ug/ml) (5hr) | Brefeldin A | IL22JOP |
IL-23 p19 | PBMC | hGM-CSF (40ng/mL) +hIL-4 (40ng/mL) | 6d | LPS (1ug/mL) (24hr) | Monensin | 23dcdp |
MCP-1/ CCL2 | PBMC | LPS (1ug/mL) | 24hr | - | Monensin | 2H5, 5D3-F7 |
RANTES/ CCL5 | PBMC | LPS (1ug/mL) | 24hr | - | Monensin | VL1 |
TNF alpha | PBMC | PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)±¥ | 5hr | - | Brefeldin A | MAb11 |
TNF beta | PBMC | Th1 polarizing cultures | 6d | PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/≠∏mL) (5hr) | Monensin | 359-81-11 |
Annotations: Iono=Ionomycin; P∏×↓MA=Phorbol Myristate Acetate; LPS=L€¥ipopolysaccharide; 2d=2 day φ•™culture; 5hr=5 hour culture; LPS f≥&↔or activation of human PBMC obtained f∏≤rom Sigma (#L-8274) | ||||||
Non-Cytokine Proteins: Intracellular"←∏ Staining Quick Guide | |
Antigen | Antibody |
Mouse/Rat Bcl-2 | 10C4 |
Mouse CTLA-4 (CD152) | UC10-4B9 |
Human CTLA-4 (CD152) | 14D3 |
Human/Mouse/Rat Cytochrome C | 6H2 |
Human Foxp3 | PCH101 |
Mouse Foxp3 | FJK-16s |
GATA3 |
|
Mouse/Human Granzyme B" | eBioGrB |
House Langerin (CD207) | eBioRMUL.2 |
Human Nanog | hNanog.1 |
Human PCNA (Prolifera$♥tin Cell Nuclear Antigen) | PC10 |
Mouse Perforin | eBioOMAK-D |
Human Perforin | dG9 |
ROR gamma |
|
Mouse SLP-76 | MS76 |
Human SLP-76 | HS76 |
Human/Mouse T-bet | eBio4B10 (4B10, 4-B10) |
Human TLR3 | TLR3.7 |
Mouse TLR9 | M9.D6 |
Human TLR9 | eB72-1665 |
Mouse/Human ZAP-70 | 1E7.2 |
Fc受體(tǐ)阻斷劑
Fc受體(tǐ)是(shì)指細胞膜表面能(néng)與免疫球蛋白(bá♠♣i)（IgG、IgA、IgM、IgE和(hé)IgD±←ε₹）Fc片段結合的(de)受體(tǐ)。目前已鑒定明(míng)确屬 π于CD抗原的(de)Fc受體(tǐ)有(yו¶ǒu)FcγR（CD64、CD32、CD16）、FcαR、FcεR。FcR能(néng≤♠)夠與抗體(tǐ)的(de)Fc段結合，在檢測時(shí)産生(shēng®€☆δ)假陽性。 使用(yòng)FcR阻斷劑，可(kě)以消除假陽性，降低(dī↕')檢測背景，獲得(de)更清晰的(de)結果。其廣泛存在£★于NK細胞、肥大(dà)細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的(§✔¶de)表面。
用(yòng)Mouse IgG2a Isotype Control FITC (cat.11-↓ε♠ε4724) (左圖) or Mouse IgG2bIsotype Control FITC (c®§at. 11-4732) (右圖)染U937細胞，沒有(yǒu)用(yòng)Hum<₹¥™an Fc gamma R-Binding I≈Ω¶nhibitor預處理(lǐ)的(de)是(shì)紫色底紋®☆←α，用(yòng)Human Fcgamma R-Binding In≤&hibitor預處理(lǐ)的(de)是(shì)藍(lán)線，紅(hóng)線是(shì)δ♦U937細胞自(zì)發熒光(guāng)。
細胞計(jì)數(shù)：123count eBeads ™π≠
² 在流式平台上(shàng)計(jì)數(shù)細胞
² 利用(yòng)抗體(tǐ)标記細胞并利用(yòng)¶♦∞123count eBeads計(jì)算(s≤£uàn)該細胞群數(shù)量
² 可(kě)同時(shí)并用(yòng)FVD細胞存活染料标記活細胞計≥Ω(jì)數(shù)
應用(yòng)領域
² 全血細胞計(jì)數(shù)
² 流式細胞儀計(jì)數(shù)功能(néng)驗證
² 精子(zǐ)濃度計(jì)數(shù)
² 可(kě)并用(yòng)細胞存活染料7-AAD，PI或FVD計(jì)數(shù)細₹∑胞存活率
² 使用(yòng)磁珠細胞分(fēn)選試劑盒後計(jì)算(suàn)細胞分(fē¥>n)選産率與純度
123counteBeads ™使用(yòng)方式₩×β☆
• 加入123count eBeads TM
• 選定待計(jì)數(shù)的(de)細胞
• 公式計(jì)算(suàn)細胞濃度
² 加入 * 已知(zhī)濃度的(de)123count eBeads 進未知(≠"'zhī)濃度的(de)細胞樣本
² 流式細胞儀同時(shí)讀(dú)取細胞與123count eBea₽≠✘ds
² 公式計(jì)算(suàn)細胞濃度如(rú)下(xià)
1. 當細胞與123count eBeads 體(< ♠tǐ)積比為(wèi)1:1混合時(shí)
實際細胞數(shù)=流式細胞儀顯示細胞數(shù)量÷流式細胞儀顯示eBead數(shù×✘¥∞)量× eBead 标示濃度
2. 如(rú)混合體(tǐ)積比不(bù)是(shì)1:1時(shí)
實際細胞數(shù)=（流式細胞儀顯示細胞數(shù)量§♣φ X eBead體(tǐ)積）÷（流式細胞儀顯示eBeaαd數(shù)量 X 細胞體(tǐ)積）X eλBead 标示濃度
*每管123count eBeads TM 标✔ ≤示有(yǒu)該管內(nèi)eBead的(de)濃度
全血CD4實際細胞計(jì)數(shù)示範
= (流式細胞儀顯示細胞數(shù)量/流式細胞儀顯示✘>•γeBead數(shù)量) X eBead标示濃度
= (541個(gè)細胞/1009 eBeads) X 998 eBeadsε "γ/ul
= 535個(gè)細胞/ul
調節熒光(guāng)補償的(de)利器(qì∞π"")——熒光(guāng)補償微(wēi)球
eBioscience抗體(tǐ)捕獲微(wēi)珠是(shì)球狀的(de)，可(kě)以和( ↑hé)熒光(guāng)抗體(tǐ)結合±λ，作(zuò)為(wèi)流式實驗的(de)補償對(duì)照(zhào)。
抗體(tǐ)捕獲微(wēi)珠分(fēn)為(wèi)陽性和(hé)陰性，陽性微(₹♦≥wēi)珠能(néng)捕獲所有(yǒu)的(de)小(xiǎo)鼠、大(dà)鼠或倉鼠抗體(₹&©tǐ)，陰性微(wēi)珠不(bù)會(huì)和(hé)抗體(t≠ε♣γǐ)反應。當熒光(guāng)共轭抗體(tǐ)&₩ π加到(dào)微(wēi)珠上(shàng)，就(jiù)可(kěΩ≈)以區(qū)分(fēn)出陰陽性微(wēi)珠，$¥₽陽性微(wēi)珠可(kě)以作(zuò)為(wèi)多(duō)色流式實驗的(de)♠•≤ 單色補償對(duì)照(zhào)。
優點：
• 通(tōng)常熒光(guāng)都(dōu)比樣本表達要(yào)強
• CV值小(xiǎo)，幾乎沒有(yǒu)背景熒光(guāng≈δΩ)
• 和(hé)你(nǐ)實際染色的(de)熒光(guāng)抗 ≥體(tǐ)結合
• 不(bù)需要(yào)使用(yòng)珍貴的(de)樣本
• 使用(yòng)簡單
OneCompeBeads和(hé)小(xiǎo)鼠、大(dà)鼠、倉鼠的(de)免疫球蛋白(bái)輕鏈反應，↔↕對(duì)488nm藍(lán)色，532nm綠(lǜ)色，561nm黃(h≥∏uáng)綠(lǜ)色和(hé)633 - 640 nm紅(hón&≥₹g)色激光(guāng)所激發的(de)熒δ'→光(guāng)染料的(de)光(guāng)譜進行(xín→↓>g)補償。可(kě)兼容eFluor® 450，但(dàn)是±♦(shì)對(duì)405 nm紫色激發的(de)光(guāng)譜不(♥ bù)能(néng)很(hěn)好(hǎo)的(de)補償。
UltraComp eBeads和(hé)小(xiǎo)鼠、大(dà)鼠、倉鼠的(de)免疫球φ≠ 蛋白(bái)輕鏈反應，能(néng)對(duì)355nm紫外(wài)≠，405nm紫色，488nm藍(lán)色，532nm綠(lǜ)色，561nm黃(huán♥₽✔g)綠(lǜ)色和(hé)633 - 640 nm紅(hóng)色激光(±•₽guāng)所激發的(de)熒光(guāng)染料的(de)光(guāng)®γ譜進行(xíng)補償。
将流式常用(yòng)的(de)13種不(bù)同的(de)PE（見(jiàn)左圖），eF>¥≈luor450（見(jiàn)右圖）共轭單克隆抗體(tǐ)和(hé)₹₩λ✔UltraComp eBeads混勻，Beads捕獲0.25 ug抗體<≤(tǐ)後上(shàng)流式細胞儀分(fēn)析，每個(gè)直方圖代表一(yī)↕ε÷∏種染色抗體(tǐ)（圖右邊是(shì)克隆和(hé)同型）。
實驗所需材料：
12x75 mm 圓底試管
直标抗體(tǐ)
流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No.00δ₹-4222)
實驗操作(zuò)流程：
準備單色補償對(duì)照(zhào)
1、 每種熒光(guāng)染料标記一(yī)個(gè)管。
2、 微(wēi)珠通(tōng)過反複颠倒或渦旋混勻，混勻時(shí)間(j§£iān)不(bù)低(dī)于10min。
3、 每個(gè)管裡(lǐ)加一(yī)滴≠εUltraComp eBeads。
4、 每個(gè)管裡(lǐ)加少(shǎo)量共轭抗體(tǐ)。
5、 用(yòng)移液槍吸打或渦旋短(duǎn)暫混勻。
6、 2-8℃避光(guāng)孵育15-30m✔₹±♥in。
7、 每管加2mL流式染色緩沖液後400♥σ-600 ×g離(lí)心3-5min。
8、 棄去(qù)上(shàng)清液，加↔↑0.2-0.4mL流式染色緩沖液。
9、 分(fēn)析前用(yòng)移液槍₽£抽打或渦旋短(duǎn)暫混勻。
