細胞表面分(fēn)子(zǐ)流式檢測步驟說(shuō)明(míng)注意事(shì)項

1． 在使用(yòng)抗體(tǐ)之前，快(kuài)速甩動一(yī)下(xià)，使之聚集到ε>≠(dào)管的(de)底部；

2． 熒光(guāng)标記的(de)抗體(tǐ)應該避光(guāng)保存在4℃，不(bù≈¥$ε)要(yào)冷(lěng)凍；

3． 當染色的(de)時(shí)候，固定或延遲分(fēn)析可β±♥(kě)能(néng)降低(dī)某些(xiē)抗體(tǐ)的(de)熒光(guāng)信号Ω✔₩。為(wèi)了(le)得(de)到(dào)更好(hǎo)的(de)結果，染色後應該馬上(β®±shàng)分(fēn)析。

過程概述：

1． 制(zhì)作(zuò)外(wài)周血、淋巴組織或者培養細胞的↓<♣₹(de)單細胞懸液；

2． 細胞染色抗體(tǐ)（包括直接标記抗體(tǐ)和↓©∞(hé)間(jiān)接标記抗體(tǐ)）；

3． 洗滌步驟棄掉所有(yǒu)的(de)為(wèi)束縛的(de)試劑

4． 運行(xíng)分(fēn)析流式儀。

注意：流式細胞染色實驗中，所有(yǒu)實驗條件(j>↔↕iàn)的(de)優化(huà)都(dōu)很(hěn)重要(yào)。關鍵參數Ω™>©(shù)包括靶細胞、抗體(tǐ)效價以及動力←δ¶×學。

試驗A：小(xiǎo)鼠淋巴細胞懸液的(de)免疫€®∑÷熒光(guāng)染色

材料：12×75 mm的(de)圓底試管（Falcon Cat.No.2008）或96孔€ 圓底微(wēi)量滴定闆（Falcon Cat.No.3910±σ），原始抗體(tǐ)（既未純化(huà)也(yě)未偶聯），

緩沖液： eBioscience流式染色緩沖液（Cat'ε.No.00-4222），流式鞘液

儀器(qì)：移液管和(hé)移液器(qì)，離(lí)心機(jī)，冰櫃或™≥♥冰箱，流式儀

試驗時(shí)間(jiān)

半個(gè)小(xiǎo)時(shí)細胞準備，半個(gè)小(xiǎo)時(shí)抗體(tǐ)✔≈↓≈稀釋和(hé)樣品準備，半個(gè)小(xiǎo)時®©♥∏(shí)到(dào)一(yī)個(gè)小(xiǎo)時(shí)孵育過≥↑↑δ程，半個(gè)小(xiǎo)時(shí)以上(shàng)的(de)運行(xíng‌≠¥)和(hé)分(fēn)析時(shí)間(jiān)

方法細胞準備：

1． 采集組織（脾，淋巴結，胸腺），用(yòng)注射器(qì)的(de)活塞擠∏​壓以制(zhì)成單細胞懸液，此過程用(yòng)1∏←λ0ml的(de)染色緩沖液；

2． 轉移到(dào)50ml的(de)圓錐形試管中并使大(dà)塊ββπ沉澱到(dào)試管底部或者通(tōng)過尼龍濾網‌§過濾，得(de)到(dào)單細胞懸液；

3． 4℃ 離(lí)心沉澱細胞懸液4-5分(fēn)鐘(zhōng©©)（300-400g），棄掉上(shàng)清；

4． 如(rú)果上(shàng)過程采集的(de)脾，還(hái)  ♦≠用(yòng)用(yòng)RBC裂解，否則進入下(xià₽♦)一(yī)步；

5． 用(yòng)50ml染色液重懸樣本，進行(xíng)細胞計(jì)數(✘≤₩shù)和(hé)活力分(fēn)析；

6． 再次離(lí)心細胞，棄掉上(shàng)清，重懸細胞使其細胞數(shù)達到(d>•★<ào)2×107 個(gè)/ml；

抗體(tǐ)的(de)準備和(hé)孵育：

1． 用(yòng)50 ?l染色液稀釋前面選的(d ₹e)抗體(tǐ)，分(fēn)裝到(dào)每個(gè)試管或微(wēi)♦≠¥量滴定闆的(de)孔中。吸取50 ?l染色液到(dào)陰性對(duì)照(zhà¥₩λ£o)試管中。在滴定實驗中，滴定範圍是(shì)2$γ-0.03?g/百萬個(gè)細胞；

2． 加入50 ?l細胞懸液（相(xiàng)當于106個(gè)細胞）₽↑π于每個(gè)試管或孔中，輕輕混勻；

3． 避光(guāng)冰浴20分(fēn)鐘(zhōng)>δ。注意：某些(xiē)抗體(tǐ)可(kě)能(néng)需要(yào)更‌εε‌長(cháng)的(de)孵育時(shí)間(π≠₽¶jiān)，用(yòng)預實驗摸索實驗條件(jα>iàn)；

4． 孵育之後，加入染色液(試管2ml，✔♦←微(wēi)量滴定闆200?l)；

5． 4℃ 離(lí)心沉澱細胞5分(fēn)鐘(zhōng)（300-↓λ∑∑400g），吸掉上(shàng)清；

6． 再重複洗2次；

7． 重懸已染色的(de)細胞沉澱物(wù)，到(dào)流式細胞儀上(shàng)分(fē∏§"n)析。

a.如(rú)果用(yòng)熒光(guāng)标記的(de)抗體(tǐ)，用'>(yòng)500 ?l染色液重懸已染色的(de)細胞 ♥₹沉澱物(wù)，然後在流式細胞儀上(shàng)分(fēn)析。

b.如(rú)果用(yòng)純化(huà)的(de)ε♣€÷或者生(shēng)物(wù)素标記的(de)抗♥÷δ✔體(tǐ)，加入合适的(de)50-100?l∞¥γ染色液（偶聯熒光(guāng)染料的(de)第二抗體(tǐ)β∞&或抗生(shēng)物(wù)素蛋白(bái)）于每個(gè)樣品中。避光(g☆♦∞φuāng)冰浴15-30分(fēn) 鐘(zhōng)，按步驟4和(hé)5洗2次。<∑用(yòng)500 ?l染色液重懸已染色的(de)細胞沉澱物(wù≥↓)，然後在流式細胞儀上(shàng)分(fēn)析。細胞染色法區(qū)分(fēn)活細λ±胞和(hé)死細胞。

注意：如(rú)果同時(shí)加入多(duō)種熒光(guāng)标記的(de)抗體(∏‌tǐ)進行(xíng)染色，孵育和(hé)洗滌的(de)步驟和(hé)上(shàng∞≠☆ε)面的(de)一(yī)樣。注意加入熒光(guāng)抗體(tǐ)後的(de)所有(yǒu)↔✘ 步驟都(dōu)要(yào)在低(dī)溫避光(guā<¥☆$ng)的(de)條件(jiàn)下(xiו₹✘à)進行(xíng)。

試驗B: 人(rén)類外(wài)周血的(de)免疫熒光(guāng)染色材料　　

12×75 mm的(de)試管（Falcon Cat.No.2008）　∑©×　

抗體(tǐ)（未偶聯或偶聯熒光(guāng)）　　

第二試劑，如(rú)果用(yòng)間(ji¶'♦£ān)接染色緩沖液　　

eBioscience 流式染色液（Cat.No.00-4®φ222）　　

鞘液　　

eBioscience 1×RBC Lysis Buffer（®×Cat.No.00-4333）

設備　　

移液管和(hé)移液器(qì)　　

離(lí)心機(jī)　　

冰櫃或冰箱　　

流式儀試驗時(shí)間(jiān)半個(gè&∏∑)小(xiǎo)時(shí)抗體(tǐ)稀釋和(hé)樣品準備€£半個(gè)小(xiǎo)時(shí)到(dào)一₹ (yī)個(gè)小(xiǎo)時(shí​☆♣ )染色過程半個(gè)小(xiǎo)時(shí)以上(shàng)的(d'≥e)運行(xíng)和(hé)分(fēn)析時(shí)間(jiān)方法≤≈≈®

1． 用(yòng)50?l染色液稀釋未偶聯或偶聯生(shēng)物(wù★∑♠)素的(de)抗體(tǐ)，分(fēn)裝到(dào)每個(gè)試管中。分"₽λ×(fēn)裝50?l染色液到(dào)幹淨的(dδ→¶☆e)或陰性對(duì)照(zhào)試管中。滴定i  ∏♦oscience抗人(rén)的(de)偶聯熒光(guāng)素的(de)抗σ>Ω×體(tǐ)20?l于每個(gè)樣品中；

2． 加100?l 全血到(dào)每個(↔ λβgè)試管中，輕輕混勻；

3． 避光(guāng)室溫孵育15-30分(fēn)鐘(zhōng)。注意：某些(xi÷'ē)抗體(tǐ)結合力較低(dī)可(kě)能(n¶δ₽éng)需要(yào)更長(cháng)的(de)孵育時(shí)間(★₩jiān)。預試驗摸索這(zhè)些(xiē)條件(jiàn)。

4． 加2ml 1×RBC（預溫到(dào)室溫）于每個( ★♦gè)試管中，輕輕混勻；

5． 避光(guāng)室溫孵育樣品10分(fēn)鐘(®∑☆→zhōng)。用(yòng)1×RBC 孵育不(bù)要(yào)超過∑≠∑♣15分(fēn)鐘(zhōng)。

6． 室溫離(lí)心樣品（300-400g），抽吸掉上(shàng)清液，然後用(yòng)♠≤2ml 染色液洗一(yī)次。

7． 重懸已染色的(de)細胞沉澱物(wφΩù)，然後在流式細胞儀上(shàng)分(fēn)析樣品。α♠

a. .如(rú)果用(yòng)熒光(gβ£uāng)标記的(de)抗體(tǐ)，用(yòng)500 ?lπ 染色液重懸已染色的(de)細胞沉澱物(wù)，然後在流式細胞儀上(shàng)分(fēn)析。

b. .如(rú)果用(yòng)純化(huà)的(de)或者生(shēng)物(wù)素标記的(✘§de)抗體(tǐ)，加入合适的(de)50-100?l染色液（偶聯熒光(g₽ uāng)染料的(de)第二抗體(tǐ)或抗生(shēng)物(wù)素蛋白(bái)）于每個(£&≈↓gè)樣品中。避光(guāng)冰浴15-30分(fēn) 鐘'★★↔(zhōng)，按步驟4和(hé)5洗2次。用(yòng)500 πΩ♦?l染色液重懸已染色的(de)細胞沉澱物(wù)，然後在流式細胞儀上(sh< >àng)分(fēn)析。細胞染色法區(qū)分(fēn↕♠)活細胞和(hé)死細胞。

注意：如(rú)果同時(shí)加入多(duō)種熒光(guāng)标記的(de)抗體(<±'tǐ)進行(xíng)染色，孵育和(hé)洗滌的(de)步驟和(££¥hé)上(shàng)面的(de)一(yī)樣。注意加入熒光(guāng)抗體(tǐ)後的(d≈¥£e)所有(yǒu)步驟都(dōu)要(yào)在低(dī)溫✘∞≤避光(guāng)的(de)條件(jiàn)下(xià)進行(xí>¶ng)。