免疫細胞化(huà)學/免疫熒光(guāng) (ICC€∑♠/IF) 是(shì)一(yī)種使用(yòng)熒光(guāng)抗體(tǐ)或染料 ♥來(lái)檢測細胞內(nèi)靶抗原的(de)技(jì)術(sh♣☆✔ù)。本實驗方案詳述了(le)使用(yòng) Cytospin™ 離(lí)心對(duì ♠§)懸浮細胞進行(xíng) ICC/IF 的(de)流程。建議(yì)收藏本文(wén)。

一(yī)般流程

1.用(yòng)聚乙烯亞胺或多(duō)聚賴氨酸塗覆蓋玻片，在室溫下(xià)放ε€(fàng)置 1 小(xiǎo)時(sh∞γΩí)。

2.用(yòng)無菌水(shuǐ)充分(fēn)漂洗蓋玻片 3 次，每次 1 小(xiǎo)時©↔(shí)。

3.充分(fēn)幹燥蓋玻片，在紫外(wàiα₽)光(guāng)下(xià)滅菌至少(shǎo) 4 小(xiǎo)時(shí)。

4.使細胞在玻璃蓋玻片上(shàng)生(shēng)長(cháng)，或制(zhì)備 Cyt→§​ospin或塗片制(zhì)備物(wù) σ↕≈。

5.用(yòng)磷酸鹽緩沖液 (PBS) 簡單漂洗。

推薦使用(yòng) 1 × PBS 0.1% Tween 20 作(zuò)為​λ→δ(wèi)洗滌緩沖液。

固定

可(kě)使用(yòng)以下(xià)兩種方法中的σ&α(de)一(yī)種固定細胞：

1.室溫下(xià)，在 100% 甲醇（-20§↑× ℃ 冷(lěng)凍）中孵育細胞 5 分(fēn↑"×↑)鐘(zhōng)。

2.室溫下(xià)，在 4% 多(du$☆•"ō)聚甲醛（溶于 PBS 中，，pH 7.₽✘✔4）中孵育細胞 10 分(fēn)鐘(zhōng)。用(♠↓¥βyòng)冰 PBS 洗滌細胞 3 次。

抗原修複（可(kě)選步驟）

在抗原修複緩沖液對(duì)細胞進行(xíng) ↑β加熱(rè)處理(lǐ)後，有(yǒu)些(xiē)抗體(tǐ)的(de)效果會"β(huì)更好(hǎo)。查看(kàn)産品信息，了(le)解每種一(yī)抗的(de)使用(yòβπng)建議(yì)。

1.将抗原修複緩沖液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，p'¥$₽H 9.5）預熱(rè)至 95 ℃。具體(tǐ)方法為(wèi)：将裝有(yǒu)¥£‍↑緩沖液的(de)蓋玻片染色缸置于水(shuǐ)浴鍋中，水(shuǐ)浴鍋的(de)溫度設為≤≥∞★(wèi) 95 ℃。

2.用(yòng)小(xiǎo)型寬頭鑷子(zǐ)小(xiǎo)心将蓋玻片置于≥π"蓋玻片染色缸內(nèi)的(de)抗原修複緩沖液中，記下(xià)長(ch§&áng)有(yǒu)細胞的(de)蓋玻片面。

3.在 95 ℃ 下(xià)加熱(rè)蓋玻片 10 分(f¶'®ēn)鐘(zhōng)。

4.從(cóng)抗原修複緩沖液中取出蓋玻片，浸入 ♦₽↓6 孔組織培養闆內(nèi)的(de) P ΩBS 溶液中，保持長(cháng)有(yǒu)細胞的(de)一σ©(yī)面朝上(shàng)。

5.用(yòng) PBS 洗滌細胞 3 次，每次™γ¶ 5 分(fēn)鐘(zhōng)。

通(tōng)透

如(rú)果靶蛋白(bái)位于細胞內(nèi)，對(duì)細胞進行(xíng)通(tōngδ')透處理(lǐ)尤為(wèi)關鍵。用(yòng)甲醇→♥♦®固定的(de)樣品不(bù)需要(yào)進行(xíng)通(tōng)透π‌♣∑處理(lǐ)。

1.用(yòng) PBS（含 0.1–0.25% Tri‌€♠ton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Sapo₩>÷nin）孵育樣品 10 分(fēn)鐘(zhōn ₽★±g)。Triton X-100 是(shì)用(∞ yòng)于提高(gāo)抗體(tǐ)滲透性最常用(yòng$∑ )的(de)去(qù)垢劑。但(dàn) Triton X-100 會(huì)破壞細胞膜≤'，因此不(bù)适用(yòng)于細胞膜抗原。

2.确定每種目标蛋白(bái)的(de) TritonΩ↑ X-100 最佳比例。

3.用(yòng) PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分(fēn)鐘(z↕♥¥hōng)

封閉與免疫染色

1.用(yòng) 1% BSA、22.52 mg/≠&mL 甘氨酸的(de) PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細↔$↔♦胞 30 分(fēn)鐘(zhōng)，封閉抗體(tǐ)的(de¶♠)非特異性結合（可(kě)替代的(de)封閉液包括 1%®'₽♦ 明(míng)膠或來(lái)源于産生(shēng)二抗 ★®←的(de)物(wù)種的(de) 10%"× 血清：查看(kàn)抗體(tǐ)數(shù)據表了(le♦↓)解相(xiàng)關建議(yì)）。

2. 室溫下(xià)，用(yòng)稀 ®釋抗體(tǐ)（溶于 1% BSA 的(de) PBST 中）在濕盒中孵育ε→​σ細胞 1 小(xiǎo)時(shí)，或 4 ℃ 過夜孵育。

3.倒出溶液，用(yòng) PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分$↑∑(fēn)鐘(zhōng)。

4.室溫下(xià)，用(yòng)二抗（溶于 1% BSA 中）避光(guāng)孵育細胞 £×1 小(xiǎo)時(shí)。

5.倒出二抗溶液，用(yòng) PBS 避光(guāng)洗滌細胞 3 ¶↔¥ 次，每次 5 分(fēn)鐘(zhōng)。

多(duō)色染色（可(kě)選步驟）

要(yào)檢測同一(yī)個(gè)樣品中兩種或多≈δ(duō)種抗原的(de)共同分(fēn)布情況，需要✘♥φ(yào)使用(yòng)雙重免疫熒光(guān§♣'g)流程。該流程可(kě)在混合物(wù)中同時(shí)進行(xíng)≥&檢測，也(yě)可(kě)逐個(gè)抗原依次進行(xíng)檢₽‍δ‌測。

确保抗體(tǐ)來(lái)源于不(bù)同物(wù)種并且這(zhè)些(xiē)抗體(tǐ)$♣★有(yǒu)相(xiàng)應的(de)二抗。例如(rú)，抗抗原 ₽∏→A 的(de)兔抗體(tǐ)和(hé)抗抗原 B 的β"♦↔(de)鼠抗體(tǐ)。也(yě)可(kě)使用(yòng)偶聯至不(bù)同熒光(guāng©π)團的(de)直标一(yī)抗。

同時(shí)孵育

1.用(yòng)封閉液孵育細胞 30 分(fēn)鐘(zhōng)>§。

2.室溫下(xià)，用(yòng)兩種一(yī)抗（溶于 1% BSA 的(de) P​☆∑BST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小(xiǎo)時‍§(shí)，或 4 ℃ 過夜孵育。

3.倒出溶液，用(yòng) PBS 洗↓<γ₹滌細胞 3 次，每次 5 分(fēn)鐘(zhōng)。

4.室溫下(xià)，用(yòng)兩種二抗（溶于 1% Bπ♣SA 中）避光(guāng)孵育細胞 1 小(xiǎo)時(sh≈ í)。

5.倒出二抗溶液，用(yòng) PBS 避光(guāng)洗滌細胞Ω&♦ 3 次，每次 5 分(fēn)鐘(zhōng)。

依次孵育

1.第一(yī)封閉步驟：室溫下(xià)，用('€α↑yòng)第一(yī)封閉液（來(lái)源于産生(shēng)二抗的(de)物(wùεΩ©★)種的(de) 10% 血清）孵育細胞 30 分ε∏γ(fēn)鐘(zhōng)。

2.室溫下(xià)，用(yòng)第一(yī)種一(yī)抗（溶于 1% BSA 或 1% 血¥₹₩™清的(de) PBST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小(xiǎo)時(shí)，或 4☆β→± ℃ 過夜孵育（一(yī)抗溶于 1% 明(m®•≠íng)膠或 1% BSA 的(de) PBST 中）。

3.倒出第一(yī)種一(yī)抗溶液，用(yòng) PBS 洗滌細胞 3 δβ次，每次 5 分(fēn)鐘(zhōng)。

4.室溫下(xià)，用(yòng)第一(yī∑®)種二抗（溶于 1% BSA 的(de) PBST 中）避光(guāng) α孵育細胞 1 小(xiǎo)時(shí)。

5.倒出第一(yī)種二抗溶液，用(yòng)<&₽λ PBS 避光(guāng)洗滌細胞 3 次，每次 5 ∑♦β'分(fēn)鐘(zhōng)。

6.第二封閉步驟：室溫下(xià)，用(yòng)第二種血清≠λ♣♣（來(lái)源于産生(shēng)二抗的(de)物(wù)種的(↔‌ ∑de) 10% 血清）避光(guāng)孵育細胞 3σ&0 分(fēn)鐘(zhōng)。

7.室溫下(xià)，用(yòng)第二種一(yī)抗（溶于 1% BSA 或&λ$¶ 1% 血清的(de) PBST 中）在濕盒中避光(guāng)孵育細胞 δα1 小(xiǎo)時(shí)，或 4 ℃≈δ&​ 過夜孵育。

8.倒出第二種一(yī)抗溶液，用(yòng) PBS 避光(guāng)洗滌細胞 3 次↑π© ，每次 5 分(fēn)鐘(zhōng)。

9.室溫下(xià)，用(yòng)第二種二抗（溶于 1% BSA 中）避光(guāng)孵育↔λ×細胞 1 小(xiǎo)時(shí)。

倒出第二種二抗溶液，用(yòng) PBS 避光(guāng)洗滌細胞 3 ☆₩¥次，每次 5 分(fēn)鐘(zhōng)。

如(rú)需檢測兩種以上(shàng)的(d<∞e)抗原，其餘抗體(tǐ)按照(zhào)步驟 1–5 繼續操作(zuò)。

複染

1.用(yòng) 0.1-1 μg/mL Hoec₹ hst 或 DAPI（DNA 染色）孵育細胞 1  ‌¶分(fēn)鐘(zhōng)。

2.用(yòng) PBS 漂洗細胞。

封片

1.用(yòng)一(yī)滴封片介質封閉蓋玻片。2.用(y≠γ✘òng)指甲油密封蓋玻片，避免樣品變幹和(hé)在顯微(wēi)鏡下(xià)移動。3.-λ↔∑20 ℃ 或 4 ℃ 下(xià)避光(guλ©₽āng)保存。