1. 實驗材料

(1) PBS

(2) Clearing and rehydration試劑：Histoc¶>÷ lear II、100%、90%和(hé)70% 酒精

(3) 熱(rè)誘導表位恢複試劑試劑（Heat induced epit≈≥★ope retrieval; HIER）：10mM檸檬酸鈉，PH6.0

(4) 抗原恢複試劑（Antigen retrieval）：蛋白(bái)酶K和(hé)胰蛋白±δ(bái)酶

(5) 內(nèi)源性過氧化(huà)酶封閉液：0.3%H2O2

(6) 封閉液：含10%FBS的(de)P§±★BS，FBS種屬與二抗來(lái)源種屬一(≥δyī)緻

(7) 一(yī)抗：純化(huà)或生(shēng)物(wù)素化(huà)Ω₩規格（供二步法使用(yòng)）

(8) 二抗：生(shēng)物(wù)素 δ化(huà)。（供三步法用(yòng)）

(9) 放(fàng)大(dà)劑：抗生(shēng)物(wù)素蛋白≤₩→≈(bái)-辣根過氧化(huà)物(wù)酶（cat≥←#18-4100）

(10) 顯色劑:30% H2O2儲液，二氨基聯苯胺（DAB）1%儲液。

(11) 細胞核複染試劑：蘇木(mù)素（Hematoxylin）

(12) 包埋劑：封蓋膠（Fisher Scientific）

2. 實驗方案

(1) 石蠟包埋，切片。

(2) 50-60度烤箱中幹燥烘烤20分(fēn)鐘(zhōng) ♣‍（注意：溫度不(bù)能(néng)超過60度以免破壞靶抗原）。

(3) 對(duì)載玻片進行(xíng)如(rú)下(xià)洗滌和(héφ₽↕≈)孵育程序，以除去(qù)石蠟和(hé)水(shuǐ)& ♦β化(huà)：Histoclear II 3 x 5 分(fēn)鐘(zhōng), 100% ®δEthanol 2 x 5 分(fēn)鐘(zhōng), 90% Ethanol 1 ✔"&x 5 分(fēn)鐘(zhōng), 70% λ Ethanol 1 x 5 分(fēn)鐘(zhōng), d∏∏↔♣dH2O 1 x 5 分(fēn)鐘(zhōng)（注意：充分(fēn)浸入，除去(qù✔ )氣泡，避免組織過分(fēn)幹燥以免影(yǐng)響後續染色）。注：若抗原在固定時(shí)容易交聯（影(yǐng)響一(yī)抗的(dσαe)特異性），則需要(yào)蛋白(bái)酶消化(huà)或枸橼酸鹽緩沖液中加熱(rè)∏≈✘除去(qù)交聯。抗原修複方法依照(zhào)靶≈♥α抗原選擇，建議(yì)沒有(yǒu)修複的(de)和(hé)修複後的(de)© ↓÷抗原同時(shí)進行(xíng)。

(4) （可(kě)選）熱(rè)修複抗原‍π表位（HIER）：将玻片完全浸沒于修複液中，微(wēi)波加熱(rè)煮沸15m¥​in，再置于枸橼酸鹽緩沖液中冷(lěng)卻至室溫'♣€•。

(5) （可(kě)選）抗原修複（蛋白(bái)消化(huà)法）：将玻片 ¥浸入蛋白(bái)酶K或胰蛋白(bái)酶中，37度孵育20min，冷(✘<★lěng)卻至室溫。

(6) 用(yòng) PBS小(xiǎo)心洗滌兩次，每次5分(fēn)>™βπ鐘(zhōng)，浸沒，低(dī)速搖晃。

(7) 如(rú)果最後要(yào)使用(yòng)過氧化(huà)物(wù)酶顯影(≤♣yǐng)，則将玻片浸入0.3%H2O2中室溫15-40min，除去(q¶₩  ù)過氧化(huà)物(wù)酶。注意：個(gè)别組織孵育時(shí)間(jiān)依照(zhào≥↓≤)過氧化(huà)物(wù)酶含量調整。

(8) 用(yòng) PBS小(xiǎo)心洗滌三次&‌☆<，每次5分(fēn)鐘(zhōng)，浸沒，低(₹←dī)速搖晃。

(9) 用(yòng)10%的(de)正常血清封閉組織上(sh™≠àng)非特異性位點，100-150ul/slide，室溫封閉1小(xiǎo)時(shí)，為••↔↔(wèi)防止封閉液蒸發，可(kě)以使用>♣(yòng)石蠟封口膜輕輕覆蓋切片，避免拉伸和(hé)産生 ∏≠(shēng)氣泡，置然後于濕盒中。

(10) 用(yòng)鑷子(zǐ)小(xiǎo)心的(de)除去(qù)封口膜，将玻片用(yò'✘λng) PBS小(xiǎo)心洗滌1次，每次5分(fēn)鐘(zhōng)，浸沒，低(dΩ™¥εī)速搖晃。